強制降解試驗屬于藥物穩定性研究內容之一，也是藥物開發研究的一部分，有助于揭示藥物的穩定特性和可能降解途徑，對于分析方法的開發和驗證也具有重要意義。
穩定性研究通過設計一系列的試驗來揭示原料藥和制劑的穩定性特征，是原料藥或制劑質量控制研究的重要組成部分，始于藥品研發的初期，并貫穿于藥品研發的整個過程。
強制降解試驗（stresstesting）屬于穩定性研究內容之一，ICH Q1A指導原則對其定義分為原料藥和制劑2個部分：強制降解試驗（原料藥）即是為了揭示原料藥內在穩定性而進行的研究，它是開發研究的一部分，這些試驗通常是在比加速試驗更劇烈的條件下進行；強制降解試驗（制劑）即是為了評估劇烈條件對制劑的影響而進行的研究，包括光穩定性研究（見ICHQ1B）和對特定制劑（如定量吸入劑、乳膏、乳劑和需冷藏的水性液體制劑）的特殊試驗。綜合以上定義，強制降解試驗是指將原料藥或制劑置于比較劇烈的試驗條件下，考察其穩定性的一系列試驗。查閱國內外相關的指導原則，除光降解試驗的條件設置在ICH Q1B 中有較明確規定外，其他高溫、高濕、酸/堿水解及氧化破壞的具體試驗條件并未有明確規定。在技術審評中發現強制降解試驗的開展常存在試驗目的不明確、試驗條件設計不合理、試驗結果評價分析不充分等問題。本文在參考相關文獻資料的基礎上，結合審評和研發工作中的理解和認識，對合理設計和開展強制降解試驗研究進行探討。開展強制降解試驗是獲得藥物可能的降解途徑和降解產物信息的重要途徑，有助于更全面了解產品的雜質譜。對于分析方法的開發和質量標準的建立具有重要意義，是雜質檢測方法建立、優化和驗證的重要研究手段?？蔀樗幤返奶幏健⒐に嚒b、貯藏條件的確定提供有益支持。然而，由于藥品的結構特性、劑型、工藝條件等各不相同，強制降解產生的雜質難于預測，對分析檢測技術要求高，常給試驗的設計和開展帶來挑戰。常見問題主要表現在未結合藥物結構和制劑特點等進行合理設計，僅套用固定經驗模式設置條件，達不到預期考察目的。如未針對藥品特點進行分析和預試驗，采用過于劇烈的破壞條件得到降解產物甚至次級降解產物，而這些降解產物存在于加速和長期試驗樣品中的可能性很小，這對于了解藥物實際穩定特性以及驗證分析方法的檢出能力的意義不大。檢測方法不適用也是常見問題，表現有未能建立合適的檢測方法檢出所有的降解產物，使主成分降解后測定的回收量偏低（質量不平衡），如降解為小分子物質（如無紫外吸收的降解產物）或形成聚合物，現有檢測方法可能無法檢出，或無法判斷色譜主峰中是否包含降解產物峰，或存在溶劑峰、輔料降解等因素造成的干擾。另外，在完成強制降解試驗后，對試驗結果評價分析不全面，未能充分理解試驗結果對分析方法優化、處方工藝改進、包材選擇等方面的指示作用，并且未能采取相應風險管理措施，也是常出現的問題。綜上所述，試驗條件設置不合理、檢測方法不適用以及對試驗結果缺乏理解分析，都會造成強制降解試驗流于形式，達不到應有的研究目的。因此，強制降解試驗需要合理的設計和開展，并對試驗結果進行充分分析和理解。一般5%~20% 的降解較為合適，需避免二次降解。對于難以降解的、非常穩定的化合物，應提供合理解釋和判斷依據。
《化學藥物雜質研究技術指導原則》中也指出，破壞試驗的程度暫無統一要求，一般以強力破壞后主成分的含量仍占絕大部分為宜。此時已產生了一定量的降解產物，與樣品長期放置的降解情況相似，考察此情況下的分離度更具有實際意義。要達到這種破壞程度，需要在研究過程中進行摸索，先通過文獻調研、理論分析或預試驗了解樣品對光、熱、濕、酸、堿、氧化條件的基本穩定情況，然后優化確定破壞性試驗條件（如光照強度、酸堿濃度、破壞的時間、溫度等），以得到能充分反映降解產物與主成分分離的結果和圖譜。檢測方法對降解產物的檢出能力和測定結果的準確性，對于開展有意義的強制降解試驗十分重要，不同的檢測方法可能獲得不同的檢測結果。降解產物通常采用色譜法測定，但由于具體藥物的特點各異，必要時可能需要結合藥物和降解產物的理化性質選擇不同的色譜方法（如HPLC，GC，TLC 等）或檢測器（如二極管陣列檢測器、質譜檢測器等），有時可組合采用不同分離機制的色譜系統。而另一方面，強制降解試驗對于檢測方法的優化、建立和驗證具有重要意義。在強制降解試驗條件下產生的降解產物較藥品貨架期產生的降解產物復雜、未知雜質多，分離難度大，因此強制降解試驗對于驗證檢測方法的專屬性具有重要的提示作用。需注意對降解前后質量平衡情況的考察，比較破壞前后檢出的雜質個數和含量，回收率偏低時考慮是否有降解產物未檢出，可能要進一步進行色譜峰純度考察。因此，開展有意義強制降解試驗需要有指示性的檢測方法，而具有指示性的檢測方法的開發和建立又是基于良好設計、有意義的強制降解試驗開展之上的。對于創新藥，由于對其各方面的性質的了解是隨研發進展不斷深入的。因此，通過設計比較完整的強制降解試驗，有利于比較全面地了解其穩定特性，從而為制劑處方、工藝的設計，以及產品儲存條件的確定等提供有益的參考。對于這類藥品，強制降解試驗開展得越早越好，如在產品開發、分析方法建立階段就可以同步進行，不要等到在長期穩定性放樣，甚至臨床使用中才暴露出問題。考察條件的設置也應盡可能全面，如盡量涵蓋光照、高溫、酸/堿水解及氧化等各種降解類型，各種降解類型考察中也可設置多種破壞強度，受試樣品可分別在固體和溶液狀態下進行考察。對于仿制藥，一般可通過文獻調研了解參比制劑或同類藥品的穩定特性及其降解途徑，并結合藥物結構和劑型特點等先驗知識，有側重地考察已有較明確提示信息的特定降解類型，如多肽藥物對光和熱敏感，或藥品結構中含有易水解基團。另外，當仿制藥處方工藝或有關物質分析方法與參比差異較大時，特別是未對各有關物質進行全面定性研究或無相應雜質對照品對有關物質分析方法進行驗證時，強制降解試驗常作為驗證檢測方法專屬性和靈敏度的重要手段。如可采用破壞性試驗得到含有雜質或降解產物的試樣，用建立有關物質分析方法與另一個經驗證的，或藥典方法進行含量測定，比較測定結果穩定性研究應檢驗那些在貯藏期間易變化的、可能影響質量、安全性和/或有效性的項目；檢驗應包括適當的物理、化學、生物、微生物學特性，以及穩定劑含量（如抗氧劑、抑菌劑）和功能性測試（如定量給藥系統）。強制降解試驗結束，應立即檢查樣品物理性質（如外觀、溶液的澄清度或顏色）的所有變化，并進行含量和降解產物的測定。必要時還可根據品種的具體情況，針對可能影響藥品安全性和/或有效性的相關質量屬性設置考察項目。一般來說，強制降解試驗只需選擇一批樣品進行，如果需進一步確認藥品穩定特性，可增加樣品批次進行考察。強制降解試驗應根據特定藥物的結構特點、理化特性、劑型、工藝、包裝、儲藏、臨床使用情況等，有針對性地設置對產品開發、生產、使用、上市后變更等具有實際指示性的考察條件。而由于藥品特點各異以及開展試驗目的不同，很難明確普遍適用的考察條件，筆者在調研相關指導原則和文獻的基礎上，對各降解類型試驗條件設置的考慮進行介紹和探討。水解反應是物質與水發生的導致物質發生分解的反應，即物質與水中的氫離子或者氫氧根離子發生反應。大多數有機化合物的水解，僅用水是很難順利進行的，一般需在堿性或酸性條件下進行，這是由于水解反應的發生需克服水解基團的水解活化能（activation energy，Ea），即需要考慮水解基團所處的電子和空間位阻效應。如藥物分子中含有的羧酸酯、羧酸酰胺及磷酸酰胺等基團通常水解活化能較低（Ea 通常＜ 20 kcal·mol-1 ），是比較容易水解的位點；如醚及磺酰胺基團，一般水解活化能較高（Ea 通常＞ 30 kcal·mol-1 ），通常不易發生水解。酸/堿水解考察條件的設置主要考慮因素包括：酸/堿溶液的濃度（或pH 值）、考察的溫度與時間，具體考察條件需根據藥品特點，特別是分析藥物結構中含有的水解基團及其所處的電子和空間位阻環境。如對于含有羧酸酯的藥物，其可能對堿水解十分敏感，就可使用較低濃度的氫氧化鈉溶液，在室溫條件下進行考察即可。而同樣對于含有羧酸酯的藥物，如果所處空間環境位阻較大，如叔丁基酯，可能水解條件需適當加強。另外，一些在水溶液中溶解度不好的親脂性藥物，需注意添加適當的有機溶劑進行增溶，不應一味地增大破壞強度，造成次級降解。常用水解考察條件包括: 0.1~1 mol·L-1 的鹽酸或氫氧化鈉溶液，在室溫或加熱條件下進行考察，如60 ℃ /2 d。光照強制降解試驗的條件設置在ICH Q1B 中有較明確規定，可分別在樣品均質化或溶液狀態下進行考察，一般要求總照度不低于1. 2 × 10^6 Lux·h（冷白光燈）或近紫外能量不低于200 w·h·m-2（紫外燈），如254 或365 nm 光源照射24 h。需注意將光照發熱對受試樣品的影響降到最低，還應考慮樣品的物理性質，并應采取措施如冷藏和/或置密閉容器中，以確保物理狀態變化（如升華、蒸發、熔化）所造成的影響最小。對于熱降解，一般遵循阿倫尼烏斯（Arrhenius）方程，即隨溫度升高降解速率加快。高溫降解試驗即運用這一原理，通過設置較高的考察溫度在較短的時間內獲得藥品的降解信息。具體考察溫度和時間需根據藥品特點，在前期預試驗的基礎上靈活確定，常見如80 ℃ /10 d，130 ℃ /8 h。也常結合濕度進行設置，如對于原料藥或固體制劑通常采用相對濕度75% 或更高（如80 ℃ /92.5% RH等），而對于液體或半固體制劑可能需考慮采用干熱條件（低濕度），如相對濕度25%或更低。受試樣品可分別在固體和溶液狀態下進行考察，需注意涵蓋生產過程中最差條件的考察，如含主藥的料液在噴霧干燥過程中溫度升高，又如半固體制劑水相或油相溶解主藥過程中可能需升高溫度。對于破壞程度過高或過低的情況，可能還需進一步結合更接近于實際高溫情況的影響因素試驗（如60 ℃ /75%RH/1 個月）的考察結果，來綜合判斷是否藥物本身對熱特別穩定或特別敏感。氧化是物質失去電子的過程，有機化學中常把脫氫稱為氧化。氧化作為藥物降解的常見形式，主要有親核氧化和自由基介導的氧化2 種途徑。親核氧化主要采用雙氧水來加速模擬親核氧化反應的發生，通常形成環氧化物、氮氧化物、砜及亞砜等降解產物。自由基介導的氧化，機制為自由基的鏈式反應，前期鏈啟動過程緩慢，特別是自發氧化，需要較長時間的介導過程；而一旦鏈式反應啟動后，降解速度會逐漸加快，因此一般不遵循Arrhenius方程，即與時間不呈線性關系，可能表現在穩定性試驗后期無規律地出現降解產物。加速模擬自由基介導的氧化通常需要光、熱、金屬離子或引發劑［如偶氮二異丁腈（AIBN）、過氧化二苯甲酰（BPO）等］觸發，常見的反應位點在共軛碳碳雙鍵的α 位、芐基位、羰基α 位等。如生產管路的硅膠管成分復雜，含有的增塑劑（如BPO）可能作為引發劑觸發自由基氧化反應。在自由基介導的氧化反應中，有一類被稱為尤頓佛蘭德（Udenfriend）反應，反應機制為:① 絡合［金屬絡合劑如依地酸二鈉（EDTA）、檸檬酸等］的還原性金屬離子（如Fe2+，Cu1+等）介導氧氣產生自由基。② 自由基形成后，通過奪取底物的電子進行傳遞，實現對底物的氧化。③ 抗氧劑（如抗壞血酸、苯酚類）或光照將被氧化的高價態金屬離子（如Fe3+，Cu2+等）又還原為低價態，繼續介導自由基的產生（見圖1）。即還原性金屬離子與金屬絡合劑絡合后，在抗氧劑存在或光照條件下，反而會加速觸發自由基的形成，導致氧化降解的發生。而針對這類氧化降解途徑的考察，常常被忽視。如常作為注射劑中的穩定劑或緩沖劑的EDTA、枸櫞酸等，可以與原輔料或生產容器管道中引入的金屬離子（如Fe2+）絡合，如果輔料或包材中含有抗氧劑（如酚類抗氧劑1010、抗氧劑1076 等），或PVC 輸液管中含有的塑化劑MBHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚，具有還原性），都可能觸發Udenfriend 反應，加速氧化降解。在氧化降解研究工作中，通常采用的試驗條件為：向受試樣品加入20%~30% 的雙氧水少量（如2mL），溶劑溶解樣品至一定容量/室溫/1~2 h。這樣的試驗條件一方面更多地體現了親核氧化途徑的降解情況，另一方面雙氧水濃度過高容易產生人為降解雜質，可能與真實降解途徑不符。以氟比洛芬為例（見圖2），在氧化條件下容易生成EP 收載的雜質C，而如果氧化條件過于劇烈，會繼續氧化成EP雜質D，甚至EP 雜質E，而在藥品常規儲藏條件下，雜質D 和E 由氧化途徑產生的機會不大。因此，氧化降解試驗需考慮試驗條件的劇烈程度以及不同氧化機制的類型，采用適宜的氧化條件進行考察。如對于親核氧化，采用0.1%~3% 的雙氧水為氧化劑/中性溶液中/室溫/7 d；對于自由基介導的氧化，采用偶氮類（如AIBN）或過氧化物（如BPO）引發/暴露于有氧環境/室溫/7 d，或溶解于金屬離子的鹽溶液（如50 mmol·L-1 的硫酸亞鐵溶液)中/暴露于有氧環境/室溫/7 d。另外，直接將樣品暴露在自然條件下（合適的光照與溫度）模擬空氣的自然氧化也有助于了解產品的實際氧化情況，但通常需設置足夠長的考察時間。綜上所述，對各降解類型的試驗設計與開展進行了介紹，但強制降解試驗不一定局限于單一降解類型的試驗條件內，可以采取更靈活的方式來更好地預測產品可能的降解途徑和降解產物。如對于原料藥，可以考察溶液狀態下產品在各破壞性條件下的變化。必要時還可以進行多種降解因素綜合存在時的強制降解試驗，如維生素K 的人工合成品甲萘氫醌二磷酸酯鈉，在一定pH 值水解條件下，首先水解生成甲萘氫醌；進而在氧化條件下，甲萘氫醌發生氧化反應，生成甲萘醌（見圖3）。完成強制降解試驗后，應根據試驗目的與藥品特點，對試驗結果進行分析和評估，充分理解試驗結果對藥物穩定特性、處方工藝、雜質檢測方法等方面的指示作用，并進行相應風險控制和改進優化。如光照降解試驗顯示受試樣品降解趨勢明顯，且存在較嚴重的質量不平衡（如回收率低于95%），此時應根據考察結果分析評估試驗的指示作用，可能還需要結合影響因素試驗的降解程度和質量平衡情況，來判斷光照試驗條件的合理性以及有關物質檢查方法的適用性。另外，試驗結果顯示受試樣品對光照敏感，就應考慮對分析檢測方法及操作、生產工藝、產品處理及存放等環節可能出現的風險進行分析和規避。本文在參考相關文獻資料的基礎上，結合個人工作的理解和認識，對強制降解試驗的合理設計和開展進行了初步的探討，建議強制降解試驗需根據試驗目的，基于對各類型降解的先驗知識，結合具體藥物自身特點，合理設計和開展，并充分分析理解試驗結果，從而更全面了解藥物的穩定特性和降解途徑，驗證和優化有關物質檢測方法，為藥物開發、生產、包裝、貯藏、使用等提供有益的參考。
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