當(dāng)前的質(zhì)粒生產(chǎn)工藝中，一般選擇大腸埃希菌作為宿主細(xì)胞(通過42℃熱激，將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中制備宿主菌株，經(jīng)過單克隆篩選和測(cè)序，獲得原始種子)，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后裂解細(xì)胞，再經(jīng)下游純化后獲得，其生產(chǎn)工序、工藝參數(shù)與質(zhì)量屬性參考如表1所示。

目前，獲批上市的CAR-T產(chǎn)品均為病毒載體(如慢病毒、γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒等載體)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此類病毒載體生產(chǎn)常用的細(xì)胞系如［人胚胎腎細(xì)胞(HEK293細(xì)胞)］通常具有轉(zhuǎn)染率高和易培養(yǎng)等特點(diǎn)。通過細(xì)胞復(fù)蘇、擴(kuò)增后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并經(jīng)收獲、純化、除菌過濾及分裝后于–80℃冷凍保存。該生產(chǎn)工藝中為了避免復(fù)制型病毒的產(chǎn)生，通常將病毒包裝所用的基因分到多個(gè)質(zhì)粒上[一般為三質(zhì)粒或四質(zhì)粒(如3個(gè)包裝質(zhì)粒和1個(gè)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒)]，采用磷酸鈣共沉淀法等方式進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，生產(chǎn)工序、工藝參數(shù)與質(zhì)量屬性參考如表2所示。

當(dāng)前，主流CAR-T產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝主要采用病毒載體(慢病毒或γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞，包括血液樣本的采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞分選(進(jìn)一步選擇和富集T淋巴細(xì)胞群)、細(xì)胞激活(使得T細(xì)胞增殖并變得可以更高效地進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo))、細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)(通過基因修飾，將CAR基因轉(zhuǎn)入T細(xì)胞中，通過細(xì)胞自身的轉(zhuǎn)錄與翻譯，在T細(xì)胞膜上表達(dá)CAR蛋白)、細(xì)胞擴(kuò)增(獲得預(yù)期產(chǎn)品與產(chǎn)量，注意擴(kuò)增前應(yīng)清除病毒)、細(xì)胞收獲、細(xì)胞收集(去除/減少雜質(zhì)、增加總體細(xì)胞濃度、進(jìn)行基礎(chǔ)制劑溶液交換)、輔料添加(將細(xì)胞與緩沖液、蛋白質(zhì)、輔助物質(zhì)和冷凍保護(hù)劑組合在一起，常見的如：5％～10%DMSO、人血白蛋白、葡聚糖、氯化鈉等)、灌裝、貼簽、凍存、運(yùn)輸至回輸?shù)裙ば颍渖a(chǎn)工序、工藝參數(shù)與質(zhì)量屬性參考如表3所示。

表1至表3中的內(nèi)容僅為初步參考，其中許多工藝參數(shù)與質(zhì)量屬性參考項(xiàng)并非嚴(yán)格意義上的CPP與CQA，列入表中的主要目的是引起適度關(guān)注，避免在產(chǎn)品研發(fā)、工藝設(shè)計(jì)及工藝驗(yàn)證中出現(xiàn)忽略或遺漏，也為藥品現(xiàn)場(chǎng)檢查工作提供參考。在實(shí)際研發(fā)及生產(chǎn)中，企業(yè)應(yīng)根據(jù)具體研究數(shù)據(jù)，基于質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理確定生產(chǎn)工藝與工序，明確產(chǎn)品各工序?qū)?yīng)的CPP與CQA，規(guī)定細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)過程中各生產(chǎn)設(shè)備和程序的選擇，以及參數(shù)設(shè)置和范圍。其中，自體細(xì)胞治療不可避免地存在患者間個(gè)體差異，應(yīng)特別注意參數(shù)范圍制定的合理性。對(duì)于同種異體的CAR-T產(chǎn)品，其生產(chǎn)工序與自體CAR-T產(chǎn)品相似，但為了降低免疫原性帶來的潛在安全性風(fēng)險(xiǎn)(如急性排斥反應(yīng))，通常會(huì)進(jìn)行額外的基因修飾(如在細(xì)胞激活后增加基因敲除步驟使細(xì)胞免疫相容)。如果質(zhì)粒、病毒載體被視為關(guān)鍵起始物料管理，需要特別關(guān)注質(zhì)粒與病毒載體來源、工藝驗(yàn)證、放行標(biāo)準(zhǔn)與進(jìn)廠檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、供應(yīng)商生產(chǎn)質(zhì)量管理能力、供應(yīng)商審計(jì)與供應(yīng)商管理等內(nèi)容，確保用于生產(chǎn)的質(zhì)粒與病毒載體能持續(xù)、穩(wěn)定地符合預(yù)定用途，其生產(chǎn)質(zhì)量管理應(yīng)能最大限度地降低污染/交叉污染以及混淆、差錯(cuò)的風(fēng)險(xiǎn)。

從驗(yàn)證的生命周期角度分析，CAR-T產(chǎn)品的工藝驗(yàn)證同樣包括工藝設(shè)計(jì)、工藝驗(yàn)證和持續(xù)工藝確認(rèn)與再驗(yàn)證等階段。企業(yè)需要在對(duì)生產(chǎn)工藝充分理解的基礎(chǔ)上，通過工藝設(shè)計(jì)識(shí)別出適宜的CPP和CQA及其范圍，通過至少連續(xù)3批成功的工藝驗(yàn)證來證實(shí)工藝設(shè)計(jì)階段的結(jié)論，證明該商業(yè)化生產(chǎn)過程符合預(yù)期，并明確后期持續(xù)監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)，后期再采用持續(xù)工藝確認(rèn)證明生產(chǎn)工藝始終處于穩(wěn)定的控制狀態(tài)；當(dāng)出現(xiàn)重大變更等情況時(shí)，進(jìn)行必要的工藝再驗(yàn)證^[12]。在CAR-T產(chǎn)品的生產(chǎn)中，工藝驗(yàn)證需要特殊考慮的內(nèi)容主要包括以下5點(diǎn)。

無菌工藝模擬試驗(yàn)的要點(diǎn)與檢查典型問題在之前的研究中已進(jìn)行了分析，要點(diǎn)包括無菌工藝模擬試驗(yàn)的范圍剛好覆蓋無菌操作全過程、影響無菌性的關(guān)鍵生產(chǎn)步驟應(yīng)盡可能與實(shí)際無菌生產(chǎn)工藝相一致、根據(jù)產(chǎn)品的不同劑型及其工藝特點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)(包括干預(yù)、最差條件、模擬試驗(yàn)方法等)，核心是體現(xiàn)該產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝對(duì)非最終滅菌藥品的無菌保證能力^[15]。在CAR-T產(chǎn)品的生產(chǎn)中，無菌工藝模擬試驗(yàn)需要特殊考慮的內(nèi)容主要包括以下4點(diǎn)。

傳統(tǒng)的生物制品通常可采用除菌過濾來去除微生物，但目前沒有適用于CAR-T產(chǎn)品的終端滅菌或除菌過濾方法。因此，為保證工藝全程的無菌，污染控制變得尤為重要。需要從影響藥品質(zhì)量的六要素(人員、設(shè)備與組件、設(shè)施環(huán)境、物料、工藝過程、檢測(cè)與預(yù)防)入手，制定并實(shí)施有效的污染控制策略[17]。與傳統(tǒng)生物制品相比，CAR-T產(chǎn)品的污染控制策略需要更加重視的內(nèi)容主要包括以下6點(diǎn)。

在藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理中，偏差處理與變更控制的基本要求與原則是一致的，但由于CAR-T產(chǎn)品生產(chǎn)的特殊性，導(dǎo)致其在生產(chǎn)系統(tǒng)中存在某些特殊的情形。對(duì)于自體CAR-T產(chǎn)品，患者年齡、健康狀況、疾病分期、既往治療史、體質(zhì)量等因素存在差異，可能影響起始細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量，或由于供體細(xì)胞已經(jīng)耗盡或者經(jīng)多輪化療導(dǎo)致細(xì)胞難以轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而影響CAR-T產(chǎn)品的生產(chǎn)過程，造成生產(chǎn)偏差。因此，對(duì)偏差的調(diào)查需要嚴(yán)格按程序執(zhí)行。偏差分析中，應(yīng)注意結(jié)合細(xì)胞治療產(chǎn)品的特殊性，進(jìn)行偏差影響評(píng)估與根本原因分析，并制定有效的糾正與預(yù)防措施。在變更控制的分級(jí)方面，應(yīng)注意區(qū)別GMP與注冊(cè)審評(píng)技術(shù)指導(dǎo)原則對(duì)不同級(jí)別變更定義與范圍的差異，并在變更控制程序中予以明確(如一些生產(chǎn)質(zhì)量管理方面的主要變更實(shí)際不涉及任何注冊(cè)審評(píng)事項(xiàng))，同時(shí)注意變更控制中的一些常規(guī)關(guān)注要點(diǎn)，如：變更的定義、適用范圍、分類、處理流程、影響評(píng)估、控制措施、措施跟蹤、編號(hào)與臺(tái)賬管理、定期分析等^[20]。其中，注意加強(qiáng)對(duì)工藝優(yōu)化、新增生產(chǎn)單元/生產(chǎn)線、工藝時(shí)間延長(zhǎng)、生產(chǎn)工藝參數(shù)調(diào)整(核準(zhǔn)范圍內(nèi))、產(chǎn)能變化等特殊變更的控制。