2024-08-20 15:35:42來源：藥方舟瀏覽量：621
mRNA技術(shù)作為一種新型的平臺(tái)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于預(yù)防性疫苗、治療性疫苗、腫瘤治療、免疫治療、蛋白替代、基因編輯等方向。mRNA在體外轉(zhuǎn)錄合成中，不僅產(chǎn)生所需的mRNA產(chǎn)物，還包括反應(yīng)酶（T7 RNA 聚合酶、無機(jī)焦磷酸酶）、NTP、DNA模板、鹽離子及副產(chǎn)物(dsRNA、截?cái)郣NA片段)等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)的存在會(huì)影響mRNA的準(zhǔn)確定量、降低蛋白翻譯效率、產(chǎn)生免疫原性等。因此在體外轉(zhuǎn)錄后需要通過純化將目標(biāo)mRNA從IVT混合物中分離純化，提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度和完整性，保證產(chǎn)品的安全性和有效性。
常規(guī)的mRNA純化方式主要有：氯化鋰(LiCl)沉淀、磁珠純化、硫酸銨沉淀、親和層析純化等，其中沉淀法、磁珠法操作相對(duì)簡(jiǎn)單快捷但體量小，因此多應(yīng)用于早期研發(fā)。在工業(yè)生產(chǎn)中，層析純化是最主要的純化方法，但是需要專業(yè)的純化設(shè)備。
原理介紹：
利用鋰離子在特定的pH下能減少 RNA分子之間的同電性相斥，使得RNA分子更容易聚集并形成沉淀，形成的RNA沉淀通過離心的方式從溶液中分離出來，得到純凈的RNA樣品。
操作步驟：
取反應(yīng)后的IVT產(chǎn)物加入LiCl溶液，-20°C放置。
離心(可觀察到出現(xiàn)白色沉淀)，棄上清。
加入預(yù)冷的70%乙醇，吹打混勻后離心(可觀察到出現(xiàn)白色沉淀)，棄上清。重復(fù)此步驟一次。
在不干擾沉淀的情況下盡量去除殘留的乙醇，然后加入RNase-free H2O或其他緩沖液溶解沉淀(建議在冰上放置讓沉淀完全溶解)。
方法特點(diǎn)：
在工業(yè)生產(chǎn)中由于殘留的鋰鹽可能具有毒性，且氯化鋰沉淀法通常需要在低溫條件下對(duì)RNA進(jìn)行沉淀，在生產(chǎn)放大時(shí)導(dǎo)致較高的能源成本和對(duì)設(shè)備的特殊要求。
對(duì)于100-200nt 的短片段RNA及濃度較低的RNA溶液，沉淀法無法有效的對(duì)其進(jìn)行沉淀。
原理介紹：
mRNA純化的磁珠有Oligo (dT)磁珠和羧基磁珠，Oligo (dT)的磁珠是利用磁珠表面偶聯(lián)的親和配體Oligo (dT)與帶Poly(A)尾的mRNA分子之間的特異性結(jié)合，通過磁力作用將目標(biāo)RNA分子與其它非特異性結(jié)合的雜質(zhì)分離開來。羧基磁珠是利用mRNA分子在酸性條件下帶負(fù)電荷，可以與羧基磁珠表面的羧基官能團(tuán)發(fā)生靜電作用，從而實(shí)現(xiàn)RNA的純化。mRNA越長(zhǎng)，表面裸露出來帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)越多，更容易吸附到磁珠，mRNA越短，需要增加磁珠體積來提高吸附能力。
操作步驟：
取反應(yīng)后的IVT產(chǎn)物加入不同體積的磁珠，混勻后室溫孵育。
將樣品置于磁力架，溶液澄清后棄上清。
加入新鮮配置的80%乙醇，室溫孵育后棄上清。重復(fù)此步驟一次。
在不干擾磁珠的情況下盡量去除殘留的乙醇，然后加入RNase-free H2O混勻，室溫孵育后取上清。
方法特點(diǎn)：
磁珠法純化能夠有效地去除蛋白、鹽離子和其他雜質(zhì)，從而獲得高純度的 mRNA。但是磁珠表面的疏水作用力會(huì)對(duì)mRNA完整性產(chǎn)生負(fù)面影響，在使用羧基磁珠時(shí)容易出現(xiàn)磁珠純化受磁珠儲(chǔ)存或者使用條件影響較大。
在使用磁珠純化時(shí)需注意：避免磁珠冷凍和高速離心，以免對(duì)磁珠產(chǎn)生破環(huán)；磁珠應(yīng)在使用前待其溫度平衡至室溫后再使用，以保證最佳的結(jié)合效率；洗滌磁珠用的乙醇-水溶液盡量現(xiàn)用現(xiàn)配或注意密封，以免乙醇揮發(fā)影響回收效率；避免磁珠過度干燥，降低洗脫效率。
硫酸銨沉淀法
原理介紹：
硫酸銨作為沉淀劑，根據(jù)目標(biāo)mRNA與雜質(zhì)之間的溶解度差異，選擇性地沉淀mRNA，并具有高溶解度和高生物安全性。
操作步驟：
溶解在pH 7.0溶液中的mRNA加入等體積的pH 7.0中制備的4M硫酸銨溶液，20℃下孵育2h。
在20℃條件下以13000rpm離心10分鐘，收集上清液和沉淀。
加入RNase-free H2O后混勻，充分溶解沉淀。
方法特點(diǎn)：
硫酸銨沉淀法的回收率較高，且對(duì)DNA模板和dsRNA的去除率較高。
純化無需特殊設(shè)備，為IVT體系或后續(xù)下游工藝中快速分離mRNA提供了理想的選擇。
親 和 層 析
原理介紹：
親和層析的主流方法是Oligo dT親和色譜，Oligo dT 填料以聚苯乙烯為基質(zhì)，表面覆蓋大量羥基、官能化聚(dT)基團(tuán)。高鹽條件下，鹽離子屏蔽同樣帶負(fù)電荷的填料骨架與mRNA的靜電排斥作用，使得mRNA分子和Oligo dT柱配基的構(gòu)象變得松弛，mRNA的poly(A) 尾與官能化聚(dT)基團(tuán)堿基配對(duì)形成氫鍵，從而捕獲 mRNA 分子，而缺乏 Ploy(A) 尾的雜質(zhì)如：游離核苷酸、短鏈轉(zhuǎn)錄本、酶等則無法結(jié)合到Oligo dT柱上。當(dāng)緩沖液沒有鹽時(shí)，dT配基主鏈上的磷酸根負(fù)電荷和poly (A) 主鏈上的磷酸根負(fù)電荷之間的靜電排斥使其遠(yuǎn)超氫鍵作用，從而使mRNA 順利洗脫下來，收率可高達(dá) 90% 以上。
傳統(tǒng)的親和層析需要專業(yè)的純化設(shè)備，純化工藝需要不斷摸索，以滿足于mRNA的工業(yè)生產(chǎn)。現(xiàn)瀚海新酶推出輕量級(jí)的親和層析純化試劑盒，無需專業(yè)的純化設(shè)備僅需離心即可，在30分鐘內(nèi)完成樣本的純化，純化后的mRNA可用于各種下游實(shí)驗(yàn)，能夠在保證高質(zhì)量同時(shí)快速方便的獲得mRNA。
親和層析純化試劑盒和LiCl
純化方法比較
（請(qǐng)備注驗(yàn)證：mRNA+姓名+公司+手機(jī)+職務(wù)）
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[4] J Koubek, KF Lin, YR Chen, RP Cheng, JJT Huang, Strong anion-exchange fast performance liquid chromatography as a versatile tool for preparation and purification of RNA produced by in vitro transcription, RNA 19 (2013) 1449-1459.
[5] Xue Feng, Zhengjun Li, Zhiguo Su, Shiyi Che, Baiqian Dai, Yuan Cheng, Songping Zhang. Rapid and high recovery isolation of mRNA from in vitro transcription system by ammonium sulphate precipitation at room temperature. Separation and Purification Technology. Volume 336, 2024, 126331.
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