中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）疾病已經(jīng)成為一項重大全球健康問題。據(jù)評估，全球遭受 CNS 疾病困擾的人口數(shù)量已經(jīng)超過 10 億，這使得 CNS 藥物的臨床需求和市場空間極大。然而，對 CNS 疾病病理機制認識的不足、血-腦屏障（BBB）和血-腦脊液屏障對藥物遞送的阻礙、臨床前動物模型數(shù)據(jù)轉化性較差，以及較高的臨床失敗率等因素，共同導致 CNS 藥物的研發(fā)面臨重重障礙，被視為“研發(fā)黑洞”。
近年來，以反義寡核酸（Antisense oligonucleotide，ASO）和小干擾 RNA（Small interfering RNA，siRNA）為代表的寡核苷酸藥物帶來了繼小分子藥物和抗體藥物之后的新藥發(fā)展第三次浪潮。與傳統(tǒng)藥物相比，寡核苷酸藥物直接與靶 RNA 結合，抑制翻譯或調(diào)控，其特異性更高、研發(fā)周期更短，并可靶向許多難以成藥的特殊靶標。在以 CNS 疾病為適應癥的領域，寡核苷酸藥物的研發(fā)勢頭日益高漲。迄今為止，在已上市的 20 款寡核苷酸藥物中，有 10 款用于治療 CNS 疾病（表1），另有多個藥物處于 Ⅱ 期及以上臨床研究階段（表2）。這些寡核苷酸藥物中，以 ASO 為主，下文所述內(nèi)容主要針對 ASO 藥物進行展開。
表1：已批準上市的用于治療 CNS 疾病的寡核苷酸藥物
表2：全球處于臨床 Ⅱ 期及以上治療 CNS 疾病的寡核苷酸藥物
由于 ASO 分子量較大，一般較難通過簡單擴散穿過血-腦屏障（BBB）并在 CNS 中達到有效濃度。研究表明，在系統(tǒng)給藥后，只有不到 1% 的 ASO 能進入大腦[1,2]。因此，為使 ASO 成功跨越 BBB 進入 CNS，往往需要采取特殊的遞送策略。
目前，中樞直接遞送 ASO 的主要方式包括：系統(tǒng)性給藥、鼻腔吸入給藥、腦室內(nèi)注射給藥和鞘內(nèi)注射給藥（圖1）[3]。其中，鞘內(nèi)注射或腦室注射可直接將 ASO 遞送至腦脊液中，是目前臨床上 ASO 進入 CNS 的主流給藥途徑。雖然枕大池注射也是將藥物直接注入腦脊液中的一種方式，但一般不用于重復給藥試驗，因為其手術風險較高，操作不當可能穿透腦干或小腦，破壞維持生命所需的關鍵結構。鞘內(nèi)注射對于脊髓和背根神經(jīng)節(jié)的分布效率更強，而枕大池注射可能更有利于轉導腦干和小腦[4]。與系統(tǒng)給藥相比，上述局部直接中樞給藥方式能使腦脊液中的藥物濃度迅速升高，無需大劑量給藥。同時，腦脊液和腦實質之間存在自由交換，而 BBB 可抑制 ASO 進入外周循環(huán)，保證了藥物分子在 CNS 內(nèi)高濃度，全身暴露量低，因此潛在的系統(tǒng)毒性風險低。但是，CNS 直接遞送的局限性也很明顯，例如侵入式給藥可能會導致與手術操作相關的不良反應（如注射部位疼痛和神經(jīng)組織損傷等），這可能會給組織病理學評估其供試品相關性帶來一些干擾。
鼎泰團隊已高效完成多個經(jīng) CNS 遞送的 ASO 藥物及其他 new modality 的非臨床研究，我們根據(jù)本團隊經(jīng)驗及相關文獻，簡要概述了向嚙齒類動物（大鼠、小鼠）及非人靈長類動物（Non-human primates，NHP，主要為食蟹猴和恒河猴）CNS 直接遞送 ASO 的操作技術及特殊考慮，并對這些遞送方式相關的組織病理學變化進行匯總和解釋，闡明這類藥物研發(fā)中安全性評估的挑戰(zhàn)。
鞘內(nèi)注射直接將藥物注入脊髓蛛網(wǎng)膜下腔，藥物可以隨腦脊液流動彌散至整個腦室系統(tǒng)，并通過軟腦膜進入腦實質[5]。雖然大鼠、食蟹猴等較大的動物也可以采用重復側腦室注射給藥，但通常鞘內(nèi)注射更為常用，主要原因為：
（1）大部分情況下鞘內(nèi)注射是更接近人類臨床的給藥途徑；
（2）鞘內(nèi)注射不需要直接穿過大腦皮層，大大減少了對局部皮質組織和周圍神經(jīng)的潛在損害。寡核苷酸藥物往往需要多次給藥，鞘內(nèi)重復給藥操作的安全性更高；
（3）大動物的腰池體積大，鞘內(nèi)注射操作更為簡便。
不同動物鞘內(nèi)給藥的操作流程大致相似，但方法細節(jié)和具體給藥部位還需考慮動物種屬的解剖學差異或年齡因素。
1.1 大、小鼠
通常在成年大鼠和小鼠中進行鞘內(nèi)注射，需將動物俯臥位固定消毒，從腰椎間隙緩慢進針，以尾巴出現(xiàn)顫動或突然的側向甩動作為穿刺成功的標志。
新生小鼠鞘內(nèi)給藥技術目前尚未應用于上市寡核苷酸藥物的臨床前評價中，但已有文獻報道了規(guī)范的操作步驟[6]，與成年動物相比主要有以下區(qū)別：
（1）新生小鼠可使用低溫麻醉，應注意避免低溫時間過長帶來的潛在風險；
（2）由于新生小鼠個體較小，可使用解剖顯微鏡輔助進行穿刺位點的確認。
（3）注射位點為兩側骨盆帶之間的中線的椎間隙；
（4）關注推注速度和體積；
（5）注重術后保溫。
1.2 NHP
NHP 是寡核苷酸藥物非臨床毒理研究最常用的動物種屬。成年和幼齡 NHP 鞘內(nèi)注射時的麻醉、消毒、動物姿態(tài)、停針等步驟大致相同。由于不同年齡動物體型差異，注射位點可能會有所不同，對于 15 個月或以上的動物，可在 L5～L6 穿刺；對于年幼的動物（9 至 15 個月），在 L4～L5 進行穿刺[7]。NHP 鞘內(nèi)注射體積有一定的限制，給藥體積較大時可能會導致腦脊液容量改變和顱內(nèi)壓升高，帶來的嚴重并發(fā)癥如惡心、嘔吐、頭痛、意識混沌和腦疝等，這可能導致額外的組織病理學改變。
文獻研究表明，食蟹猴重復鞘內(nèi)注射 ASO 可能出現(xiàn)一系列神經(jīng)系統(tǒng)變化[7]，這些變化出現(xiàn)的時間、癥狀表現(xiàn)、嚴重程度及與供試品的相關性在表3中進行了總結。
表3：食蟹猴鞘內(nèi)注射重復給予 ASO 藥物后的一系列神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[7]
在臨床上，具有神經(jīng)活性的寡核苷酸藥物最常用的局部給藥途徑是鞘內(nèi)注射，但小鼠或幼齡嚙齒類動物椎管和腰池體積小，重復鞘內(nèi)注射操作困難、風險較高。在這種情況下，側腦室是更為可靠的注射位點。進入腦室的藥物途經(jīng)室管膜細胞層進入實質發(fā)揮作用，文獻研究表明，小鼠重復側腦室注射與大鼠及 NHP 重復鞘內(nèi)注射后，ASO 在腦和脊髓中的分布相似[8]。小鼠或幼齡嚙齒類動物可進行單側或雙側腦室注射，新生小鼠腦容量小，注射體積有限，通常不超過 5μL/單側腦室[9]。雙側腦室注射可以給予更大容量的藥物，有助于藥物在大腦中實現(xiàn)更廣泛的分布，但由于手術操作帶來的機械損傷也會更大。小鼠重復腦室內(nèi)注射通常限制在不超過 5 次，以防止由于累積的局部組織損傷引起的發(fā)病率和/或死亡率，每次沿同一軌跡穿刺會盡可能減少這種損傷[8]。新生小鼠側腦室注射常在動物出生后的第 1 周內(nèi)進行，隨著動物年齡的增長，注射操作會變得越來越具有挑戰(zhàn)性，對動物的傷害也會越大[9]。
對于成年的嚙齒類動物和 NHP，鞘內(nèi)注射往往是向 CNS 內(nèi)遞送寡核苷酸藥物的首選方式，較少采用側腦室注射。
中樞神經(jīng)藥物直接遞送可能導致一些局部組織病理學改變。如何區(qū)分是給藥操作導致改變還是供試品導致的改變變得非常挑戰(zhàn)。首先是因為對照組和供試品組的組織病理變化通常很相似，差異可能只是發(fā)生率和嚴重程度不同。其次，非嚙齒動物的非臨床研究中每組動物數(shù)量較少（一般為 5 雌 5 雄），這增加了判斷操作相關或供試品相關變化的難度。
在進行病理學評估時，研究人員需要詳細檢查一系列神經(jīng)組織，包括腦和脊髓，以及注射部位。腦和脊髓均可以根據(jù)需要進一步采用分區(qū)域取材。樣本在中性緩沖福爾馬林（NBF）中固定 24 到 48 小時，并切片為 4 到 5μm。對于一般篩查，切片用蘇木精-伊紅（H&E）染色[10]。如果需要，可以將特殊的神經(jīng)組織學方法應用于選擇的 CNS 區(qū)域或結構的連續(xù)切片，以更好地表征供試品遞送方式或供試品本身的組織反應[11]。
表4：腦室內(nèi)注射小鼠對照組中的操作相關顯微鏡發(fā)現(xiàn)[10]
2.1 大、小鼠
在大鼠鞘內(nèi)注射研究中，操作相關的顯微鏡發(fā)現(xiàn)包括有腦輕度單核或混合細胞浸潤，急性實質性和/或腦膜出血灶，白質束內(nèi)輕度神經(jīng)纖維變性和散在的膠質增生等改變。脊髓最常見的發(fā)現(xiàn)是注射部位及其附近節(jié)段的背束和/或側束白質的不對稱神經(jīng)纖維變性，局部單核或混合細胞浸潤、腦膜和脊髓周圍結締組織的局部纖維化、異物肉芽腫、腦膜和/或實質性出血以及膠質增生。外周神經(jīng)系統(tǒng)最常見的發(fā)現(xiàn)包括 DRG 中的神經(jīng)纖維變性，通常局限于脊神經(jīng)根，以及 DRG 神經(jīng)元場和/或周圍結締組織中的單核細胞浸潤。坐骨神經(jīng)中的神經(jīng)纖維變性通常也是輕度的。詳見表5。
表5：鞘內(nèi)（IT）注射后對照大鼠常見操作相關顯微鏡發(fā)現(xiàn)的發(fā)生率[10]
圖2 與大鼠鞘內(nèi)導管插入相關的發(fā)現(xiàn)，導管插入點鄰近腰骶脊髓[10]
圖2A：多根脊神經(jīng)根旁邊的鞘內(nèi)導管位置表示為一個圓形的透明區(qū)域。
圖2B和圖 2C：放大后，導管位置周圍有纖維化環(huán)，表示對導管的局部慢性反應。密集的纖維組織與腦膜連續(xù)并壓迫附近的神經(jīng)根。
圖2D：受影響的神經(jīng)根中可以看到輕度的神經(jīng)纖維變性和神經(jīng)膠質（Schwann細胞）增生（箭頭），許多局部毛細血管充血。
2.2 NHP
在非人靈長類動物的鞘內(nèi)注射研究中，常見的操作相關性改變包括有腦白細胞浸潤，主要在腦膜、脈絡叢、神經(jīng)實質和/或血管周圍。其它變化還可能有腦膜和/或實質性出血、膠質增生、充血和腦膜纖維化。脊髓腦膜、血管周圍間隙、神經(jīng)實質和/或相關的脊神經(jīng)根中的單核細胞浸潤，脊髓白質或相關神經(jīng)根中的神經(jīng)纖維變性，膠質增生，腦膜和/或實質性出血，腦膜纖維化和慢性炎癥（有時描述為“肉芽腫性”）。DRG 和相關神經(jīng)根可見神經(jīng)元自噬、單核細胞浸潤和礦化。常見的變化還包括神經(jīng)纖維變性、單核細胞浸潤、水腫和膠質增生。坐骨神經(jīng)中常見的變化包括單核細胞浸潤、水腫和礦化。詳見表6。
表6：鞘內(nèi)（IT）注射后對照食蟹猴常見操作相關顯微鏡發(fā)現(xiàn)的發(fā)生率[10]
圖3 獼猴腰池鞘內(nèi)注射部位的操作相關發(fā)現(xiàn)
圖3A：腦膜中與混合細胞浸潤相關的纖維化（箭頭）。
圖3B：馬尾神經(jīng)根中的血管周圍單核細胞浸潤（箭頭）。
圖3C和圖3D：脊髓白質中伴有神經(jīng)膠質增生和單核細胞浸潤的神經(jīng)纖維變性（盒中區(qū)域）。受影響區(qū)域內(nèi)有腫脹和/或碎裂的嗜酸性軸突（黑色箭頭）和消化室（黑色箭頭）。
有文獻報道在小鼠的腦室內(nèi)注射研究中，注射部位局部發(fā)現(xiàn)包括各種腦膜層之間和/或腦膜與顱骨之間的粘連，腦膜纖維增生或纖維化，異物（通常是骨或毛發(fā)碎片），伴有或不伴有肉芽腫形成，顱骨骨折有時伴有骨痂形成，出血，單核細胞或混合細胞浸潤，混合細胞炎癥和/或巨噬細胞浸潤。
圖4 小鼠腦室內(nèi)（ICV）注射相關的發(fā)現(xiàn)[10]
圖4A：小鼠大腦皮層周圍腦室周圍水腫和出血（框選區(qū)域）。
圖4B：注射部位腦膜的纖維-骨增生。注意腦膜中的新生成纖維組織和骨組織（框選區(qū)域），以及附近的自由毛發(fā)軸，周圍有單核細胞、巨噬細胞和一個多核巨細胞（黑色箭頭）。
圖4C和圖4D：小腦腦膜（圖2C及插圖）和側腦室（圖4D）內(nèi)的混合細胞炎癥和出血。
隨著寡核苷酸藥物的研發(fā)，中樞遞送給藥方式也逐漸推廣應用。在這類藥物研發(fā)中安全性評估有一定挑戰(zhàn)， 例如給藥操作相關的病理學變化與供試品相關的病理學變化可能呈現(xiàn)出相似性。我們需對病變進行仔細檢查，結合病理改變的特點，發(fā)生率和嚴重度，以及測試物的信息等進行綜合的毒性評估。
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