2024-03-04 17:38:10來源：鼎泰瀏覽量：727
siRNA 藥物合成路徑和雜質來源
與小分子化學藥物不同，siRNA 藥物具有更大的分子量和更復雜的化學結構，其研發和生產過程中產生的雜質也異常復雜。如何科學評估siRNA藥物雜質的影響和合理控制其限度，是業界亟待探索的重要課題。
眾所周知，siRNA主要是通過固相合成（solid-phase synthesis，SPS），常伴隨產生多種工藝相關（如起始原材料、中間體、配體和保護基團殘留等）或產品相關雜質（與活性成分結構接近的副產物），這些雜質可能會對siRNA藥物的質量和安全性造成潛在影響。
siRNA 藥物雜質研究遵循的指導原則
siRNA藥物相關的有機雜質、無機雜質、殘留溶劑和元素雜質等可遵照ICH Q3系列指導原則；考慮到與常規化學藥物之間的差異，siRNA藥物產品相關的雜質的報告限度（Reporting threshold）、鑒定限度（Identification threshold）和界定限度（Qualification threshold）不能完全按照ICH Q3A確定。因此，對siRNA藥物各類雜質水平的科學控制尤為關鍵。
siRNA 藥物雜質研究的考量因素
1
對于雜質研究的化學考量
? 雜質表征
對產品相關雜質的表征是任何新化學實體開發過程中的一項重要工作，需以對合成工藝、起始物料和潛在降解途徑的詳盡評估為指導。由于siRNA 藥物的平臺特性，基于一個分子上獲得的信息可用于指導其他分子的雜質研究，減少重復性工作。對于已有充分文獻報道的雜質，對表征研究的要求較低；對于首次報道的雜質，則需要更全面的數據支持其表征研究。對于由多個成分構成的混合雜質，通常不需要逐一解析不同成分的結構。有一句老話 “A day in the library saves a month in the laboratory”用來形容siRNA 藥物雜質研究特別貼切。
? 分析方法
應盡可能開發能有效分離雜質與siRNA藥物序列以及不同雜質的分析方法，如毛細管凝膠電泳法（CGE）、陰離子交換色譜等。近年來，離子對高效液相色譜-電噴霧電離質譜聯用（IP-HPLC-ESI-MS）技術的應用日益廣泛。對雙鏈siRNA藥物，除了分析單個單鏈外，還需要在非變性條件下進行分析，以將殘留單鏈和聚集體與siRNA藥物雙鏈進行分離和定量。
? 雜質報告
與小分子化藥一樣，siRNA 藥物的質量標準中也需列明特定雜質和非特定雜質。前者有助于評價生產工藝中特定步驟或控制策略的成效，如單鏈寡核苷酸通常含有較低水平的 n - 1 雜質，其水平在很大程度上取決于固相合成工藝中脫苯甲基步驟是否成功?？紤]到siRNA 藥物雜質難以全部有效分離，特定雜質常需要以組的形式報告，如將n-1或n+1的所有組分歸為一組。
對于大多數小分子藥物，報告限度設定為0.05%或 0.03%。鑒于分離和分析方法的局限性，目前尚沒有形成廣泛接受的寡核苷酸藥物的報告限度、鑒定限度和界定限度。在大多數情況下，設置0.2% 的報告限度、1.0% 的鑒別限度和1.5%的界定限度可能是適用的。
2
對于雜質研究的安全性考量
對于雜質安全性角度的考量主要集中在對雜質界定的定義上。對于小分子化藥，雜質界定被定義為“獲得和評價某些數據的過程，這些數據可用于確保單個雜質或在特定的含量下的一系列雜質的生物安全性”[2]。根據ICH Q3A，對于一個通過充分的非臨床安全性研究和臨床研究的新原料藥，其任一雜質的水平已經得到合理界定。對于動物/人體中的重要代謝物的雜質，通常也視為已通過界定。如果雜質的界定水平（Qualified level）高于告訴實際所含的雜質量（質量標準限度，Specification limit），同樣可以根據完成的安全性研究中使用的實際雜質量來判斷其合理性（圖1）。
圖1. 安全性數據（Qualified Level）、質量標準限度（Specification Limit）、鑒定限度（Identification Threshold）和界定限度（Qualification Threshold）的關系[1]
如果無法獲得足夠數據支持擬定的限度且超過界定限度，則必須開展進一步研究以支持該限度的合理性。對于某些藥物，可以根據科學原理和認知水平（如藥物的類別和臨床經驗），對其雜質界定限度進行適當調整?？傊?，對限度的確定應具體情況具體分析。上述基本原則同樣適用于siRNA 藥物。
siRNA 藥物雜質界定研究策略
1
識別雜質類別
根據結構，可將雜質分為四類，每類雜質的安全評估要求不同：
Class I：與siRNA藥物序列相同的代謝產物類雜質，如缺少末端堿基的雜質，其安全性已在非臨床評價中確立，不需要進一步評估。
Class II：僅含天然核酸中存在的結構元素的雜質，如磷酸二酯雜質，可以視為安全，不需要進一步評估。
Class III：與siRNA藥物序列不同但不含新結構元素的雜質，如n-1、n+1，單個雜質水平很難達到危害水平，一般不需要動物試驗。
Class IV：含siRNA藥物和天然核酸都不具有的新結構元素的雜質，若其限量超過1.5%的界定限度時，需進行非臨床安全性研究。
2
非臨床評價設計
為了對Class IV類雜質進行界定而進行非臨床研究時，動物種屬、供試品、研究周期和劑量水平是重要的設計要素。
動物種屬：與ICH Q3A中給出的建議一致，該研究可僅在一種嚙齒類動物中進行。
供試品：盡管選擇生產僅含有雜質或雜質混合物的樣品是可以接受的，通常更傾向于使用由摻入了相關雜質的siRNA藥物，主要是因為：1）生產富含雜質的siRNA藥物往往比生產單純的雜質更實用；2）在siRNA 藥物存在的情況下，評估雜質的安全性更能代表雜質在患者中暴露的真實情況。
許多常見siRNA 藥物雜質，例如 abasic 和 CNET 雜質，均為單個成分組成的混合物，它們之間的區別僅在于序列中的位置。對于該類雜質，評估其中的一個代表性雜質通常足夠，但評估同一類雜質的混合物也是允許的，而且由于合成方面的考慮，有時實際上也是不可避免的。根據經驗，最有效的雜質評估方法是采用盒式設計（Cassette maner），將siRNA 藥物與一種以上的雜質配比混合后共同給藥。
研究周期：一般來說，研究周期應足以確保在值得關注的組織中達到穩態濃度。對半衰期較長、計劃長期使用的siRNA，可能需要長達13周的給藥（表1）；對于在組織中半衰期較短或不計劃長期使用的siRNA，可以短期給藥。給予的雜質的量應等于或超過期望的覆蓋水平。
劑量水平：建議至少設置2個劑量水平，低劑量應為預期的NOAEL，高劑量應擴大治療窗口或足以產生與siRNA 藥物一致的毒理學效應。除了摻雜的供試品組外，還應設置給予供試品或溶媒的對照組。每組動物數應足夠，如10只/性別/組。
表1. 小鼠重復給藥13周雜質界定試驗設計[1]
3
毒理學評估
毒理學評估的指標應包括：in-life 觀察（如體重、攝食量、臨床觀察和眼科檢查）、臨床病理（包括血液學和血清生化等）、大體解剖、器官重量和組織病理學檢查；還應檢測siRNA在組織中的濃度，以評估暴露情況。
4
計算毒理學覆蓋范圍
在研究中產生的毒理數據可以用來計算，主要有兩種方法。一種簡單的方法是將供試品中雜質百分比設為覆蓋率，如安全劑量大于或等于臨床劑量，該方法是有效的；另一種更為靈活的方法是計算適當劑量下供試品中實際存在的雜質量，以相對于臨床劑量的百分比表示，作為覆蓋范圍（表2）。
表2.計算毒理學覆蓋范圍的可能方法[1]
5
siRNA藥物雜質界定決策樹
對于小分子化學藥而言，降低雜質含量使其低于限度通常要比提供雜質的安全性數據來得簡單。根據ICH Q3A中的推薦的決策樹，當雜質含量超過限度且已有信息不足以提示其安全性時，應考慮進行額外的安全性試驗。如何合理地界定一個雜質將取決于許多因素，包括患病人群、每日劑量、給藥途徑與療程。
對于siRNA藥物來說，通過工藝優化進行雜質水平的控制可能同樣是適用的，只不過限于固相合成工藝的特殊性和生產成本方面的考慮可能需要綜合研判。對于siRNA藥物雜質的界定決策樹，有其自身的特殊之處，主要體現在觸發雜質界定研究的條件和邏輯不完全相同、需要開展的界定試驗也不相同。
已上市 siRNA 藥物雜質控制案例分析
結語
大部分siRNA藥物相關雜質主要包括與起始物料、生產工藝等相關的雜質，建議對雜質進行歸類和報告。鑒于檢測方法的限制，siRNA 藥物雜質的報告限度、鑒定限度和界定限度采用高于ICH Q3A中的相應水平可能是合理的。對于含有在siRNA原形藥物或天然核酸中所沒有的結構元素的雜質，需要進行非臨床安全性評價。在嚙齒類動物重復給藥毒性試驗中，可伴隨進行雜質安全性評估。毒理批次的雜質譜宜涵蓋臨床批次的雜質譜。
本文綜合相關指南、文獻資料及FDA 已批準上市siRNA 藥物的案例分析，就siRNA藥物雜質問題提供了一定的科學建議，旨在確保藥物的質量和安全性，并指導非臨床研究設計和助力臨床轉化。
參考資料：
[1] Daniel Capaldi, Andy Teasdale, Scott Henry, et al. Impurities in Oligonucleotide Drug Substances and Drug Product. NUCLEIC ACID THERAPEUTICS. 2017
[2] ICH Q3A(R2). Impurities in New Drug Substances. https://www.ich.org/page/quality-guidelines
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