在人類的大腦中，單胺神經(jīng)遞質(zhì)執(zhí)行著重要的信號傳導(dǎo)功能，如運動、睡眠、獎勵和情緒等。其中，囊泡單胺轉(zhuǎn)運蛋白?(?VMAT?)?起到了關(guān)鍵的作用，這種蛋白位于突觸小泡，負(fù)責(zé)單胺神經(jīng)遞質(zhì)的轉(zhuǎn)運，一旦?VMAT?發(fā)生突變便會導(dǎo)致單胺能神經(jīng)回路的功能障礙，誘發(fā)各種?神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)精神疾病，如抑郁癥、帕金森病和舞蹈病等。

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2023?年?11?月?1?日，美國圣裘德兒童研究醫(yī)院李佳學(xué)、北京大學(xué)張哲共同通訊在?Nature?上發(fā)文?Mechanisms of neurotransmitter transport and drug inhibition in human VMAT2?，?揭示了 VMAT 的底物轉(zhuǎn)運機制和藥物抑制的分子機制，為理解突觸囊泡轉(zhuǎn)運蛋白包裝神經(jīng)遞質(zhì)的生理學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)提供了理論框架。

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單胺 是一類重要的?神經(jīng)遞質(zhì) ，主要包含?多巴胺 ( dopamine，DA ) 、血清素（又名 5- 羥色胺，serotonin，5-HT）、去甲腎上腺素 ( noradrenaline, NE ) 和腎上腺素 ( adrenaline, E )??等。單胺能神經(jīng)元回路 在運動、睡眠、獎勵、情緒等生理和認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。這些神經(jīng)遞質(zhì)在突觸前神經(jīng)元合成，并由?囊泡單胺轉(zhuǎn)運蛋白?(?VMAT?)?包裝運輸?shù)酵挥|小泡中。

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在小鼠和人類當(dāng)中，VMAT 轉(zhuǎn)運蛋白的缺失或缺陷可能導(dǎo)致死亡率增加、發(fā)育遲緩、肌張力障礙和帕金森癥等疾病。因此，VMAT 作為重要的治療靶點，在高血壓、精神病性躁動、精神興奮劑濫用、亨廷頓舞蹈病以及其他多動性運動障礙的藥物開發(fā)中起到了關(guān)鍵的作用。然而，這些轉(zhuǎn)運蛋白的底物轉(zhuǎn)運以及藥物抑制機制仍然未知。

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由于人 VMAT2 蛋白尺寸小?(?~56kDa )?且大部分嵌入脂質(zhì)雙層膜中，缺乏剛性可溶域，使得冷凍電鏡的拍攝和結(jié)構(gòu)測定比較困難。本研究采用了一種?融合蛋白策略 有效的擴大了蛋白顆粒尺寸，從而首次成功拍攝到了目標(biāo)蛋白與抑制藥物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。

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研究使用螺旋接頭將麥芽糖結(jié)合蛋白?(?MBP?)?標(biāo)簽附加到?VMAT2?的?N?末端，并在?C?末端連接一個經(jīng)過設(shè)計的特異性識別?MBP?標(biāo)簽的?錨蛋白重復(fù)折疊蛋白（DARPin），得到修飾后的轉(zhuǎn)運蛋白??VMAT2?EM?。

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VMAT2?EM??在 HEK293 細(xì)胞中的多巴胺轉(zhuǎn)運能力與未修飾的 VMAT2 相當(dāng)，且同樣對 TBZ 和利血平敏感。在冷凍電鏡下分別以 2.9 ??和 3.2 ??的分辨率拍攝到 VMAT2?EM?與 TBZ 和利血平結(jié)合的結(jié)構(gòu)。

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▲?VMAT2?與治療藥物復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)

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VMAT2?是由?12?個跨膜螺旋?(?TM?)?組成的典型?MFS?折疊轉(zhuǎn)運蛋白，具有兩個結(jié)構(gòu)相似的結(jié)構(gòu)域，?N 結(jié)構(gòu)域?(?TM1-TM6?)?和 C 結(jié)構(gòu)域?(?TM7-TM12?)?。其間的中心空腔是通常情況下底物的結(jié)合位點，靶向 VMAT2 的抑制劑通過改變 N 結(jié)構(gòu)域和 C 結(jié)構(gòu)域向外（細(xì)胞質(zhì)）或向內(nèi)（囊泡腔）的構(gòu)象來抑制其與底物的結(jié)合與轉(zhuǎn)運。

VMAT2 與 TBZ 結(jié)合

VMAT2?EM?-?TBZ??復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)顯示，TBZ?位于由?TM1?和?TM4?（N域）以及?TM7?和?TM10?（?C?域）形成的中央空腔中，并且誘導(dǎo)轉(zhuǎn)運蛋白向內(nèi)腔的閉塞構(gòu)象，將 VMAT2 鎖定在對膜兩側(cè)都封閉的中間狀態(tài)，抑制其底物轉(zhuǎn)運功能。

▲TBZ的抑制機制

VMAT2 與利血平結(jié)合

由于利血平與?VMAT2?的結(jié)合需要跨膜質(zhì)子梯度，作者在?VMAT2?EM?中引入了替換，使用??VMAT2?EM??Y418S 突變體與利血平結(jié)合，模擬在細(xì)胞中的真實結(jié)合狀態(tài)。與 VMAT2?EM?-?TBZ??復(fù)合物面向內(nèi)腔的閉塞構(gòu)象相反，利血平結(jié)合的?VMAT2?構(gòu)象面向細(xì)胞質(zhì)開放，這是一種準(zhǔn)備從細(xì)胞質(zhì)中攝取單胺神經(jīng)遞質(zhì)的狀態(tài)。

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利血平位于中央空腔，長軸夾在 N-結(jié)構(gòu)域和 C-結(jié)構(gòu)域之間，并與跨膜螺旋平行排列。與 TBZ 的結(jié)合機制不同，這種結(jié)合通過阻斷易位途徑，防止胞質(zhì)中的單胺進入轉(zhuǎn)運蛋白，與底物形成直接競爭關(guān)系。

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▲利血平的抑制機制

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VMAT2 結(jié)合并轉(zhuǎn)運血清素

為了進一步了解藥物的作用機制以及神經(jīng)遞質(zhì)運輸?shù)倪^程，作者在?3.7???分辨率下拍攝到?VMAT2?EM?Y418S 的血清素?( 5-HT )?結(jié)合結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)顯示?5-HT?結(jié)合的?VMAT2?采用面向細(xì)胞質(zhì)的開放構(gòu)象?，吲哚環(huán)通過與 V232 和 I308 的疏水相互作用而穩(wěn)定，氨基與 E312 的側(cè)鏈羧酸酯基團形成鹽橋。該結(jié)合位點?與利血平吲哚基團的位點重疊?，因此解釋了利血平阻礙 VMAT2 與血清素的結(jié)合與轉(zhuǎn)運的競爭機制。

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? ? ?▲血清素結(jié)合和識別

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在比較了?VMAT2?面向細(xì)胞質(zhì)和面向囊泡內(nèi)的構(gòu)象后，作者提出，VMAT2?的?N?結(jié)構(gòu)域和?C?結(jié)構(gòu)域通過模擬搖桿開關(guān)的運動方式實現(xiàn)底物的轉(zhuǎn)運。在面向細(xì)胞質(zhì)的狀態(tài)下， VMAT2 的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域開放，允許底物進入。底物的結(jié)合觸發(fā)細(xì)胞質(zhì)門的關(guān)閉，這一過程主要由 TM4 、 TM5 、 TM10??和 TM11 上的兩層蛋氨酸和酪氨酸殘基之間的相互作用形成。

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在底物易位的過程中， VMAT2 會發(fā)生構(gòu)象改變， W318 擺動，打開由 TM1 的 V41 和 P45 以及 TM7 的 E312 、P313 和 P316 組成的面向囊泡腔的門，將底物釋放到囊泡腔中。在底物釋放后， VMAT2 與囊泡腔中的質(zhì)子結(jié)合，使轉(zhuǎn)運蛋白返回其面向細(xì)胞質(zhì)的構(gòu)象，進行下一次底物轉(zhuǎn)運。

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▲底物易位機制

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