上皮-間質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）在很多癌癥的發展中發揮著至關重要的作用，包括癌細胞的遷移、侵襲、血管生成和耐藥等。EMT主要通過上皮細胞標志物cytokeratins和E-cadherin的缺失和間充質細胞標志物N-cadherin、vimentin和纖連蛋白的上調等指標進行檢測，這一轉化過程會導致細胞之間的粘附性降低[5]。雜合EMT的主要特征是腫瘤細胞中上皮基因和間質基因的共同表達，促進癌癥的發生、轉移和浸潤[6]。

EMT的發生發展與MEK1/2-ERK1/2-Fra1-ZEB1/2信號通路的激活成正相關，Wu[7]等人研究了MEK1/2-ERK1/2-Fra1-ZEB1/2的上游調控因子CRAF與PLK1的互作在EMT過程發揮的重要作用。PLK1直接磷酸化S338和S339位點的CRAF，激活CRAF；活化的CRAF經過S621位點的自磷酸化，阻止了蛋白酶介導的CRAF降解，CRAF的穩定也在一定程度上增加了PLK1的磷酸化，進而產生了一個正反饋的循環。該研究將過表達PLK1的前列腺上皮細胞RWPE-1移植到小鼠體內，在NSG小鼠中RWPE-1-PLK1表現出致瘤性和促使腫瘤轉移的能力。

圖2.1.2 PLK1在RWPE-1細胞中的異位表達的致瘤性和肺部微轉移[7]

肺癌已經成為全球主要致死癌癥之一，約40%的肺癌患者都會發生腫瘤轉移，轉移至腦、肝和腎上腺等部位，嚴重威脅人的生命[8]。非小細胞肺癌 (NSCLC) 患者約占所有肺癌的 85%，生存率極低，臨床相關性結果表明，PLK1和TNFAIP6是轉移性 NSCLC 患者生存率低的強預測因子。研究[9]發現在T210位點磷酸化的PLK1能促進癌細胞的遷移、侵襲和致瘤性，而PLK1活性的喪失阻止了腫瘤發生和轉移活性，S137磷酸化的PLK1則不具有該特性。T210- PLK1 的表達激活 了TGF-β 信號通路并上調TNFAIP6，從而促進 NSCLC 的轉移和侵襲。因此，PLK1 和 TSG6 是轉移性非小細胞肺癌治療的有價值的治療靶點。PLK1促進EMT的作用同樣在胃癌細胞系SGC7901和MKN28中得到驗證，并得出PLK1可能通過AKT信號通路促進胃癌的轉移[10,11]。

2.2?細胞凋亡

上皮-間質轉化發生在相當一部分 NSCLC 病例（≥20%）中，可介導癌基因成癮、表皮生長因子受體抑制劑耐藥和化療耐藥的喪失。PLK1 抑制導致 G2/M 期阻滯，但只有治療敏感的細胞系在 PLK1 抑制后發生大量凋亡。具有高上皮-間質轉化基因特征評分的 NSCLC 細胞系（間充質細胞系）對 PLK1 抑制的敏感性高于上皮細胞系；蛋白質組學分析結果得到相同的結論[12]。通過表達 miR-200 誘導上皮表型增加了細胞對 PLK1 抑制的抗性。該研究將腫瘤分為上皮細胞系和間充質細胞系兩種亞型，針對不同亞型對PLK1抑制劑的敏感性，對腫瘤進行治療，在臨床應用上具有重要意義。Caspase-9是參與細胞凋亡的關鍵酶。Plk1的表達增加了pro-Caspase9和pro-Caspase3的水平，抑制了細胞凋亡，表明Plk1具有抑制細胞凋亡的作用[13]。

焦亡被稱為炎癥引起的細胞程序性死亡，屬于凋亡的一種，在近年來受到諸多關注，NLRP3、GSDMD、AIM2、NLRC4、NLRP1等是焦亡研究中最受關注的位點。最近，研究發現PLK1抑制劑被證實是一種有效的治療食管鱗狀細胞癌(ESCC)的方法，BI2536 通過激活caspase-3，誘導GSDME高表達細胞系中GSDME裂解為C-末端片段 (GSDME-CT) 和 N-端片段 (GSDME-NT)，GSDME-NT 也參與膜孔的形成，導致細胞焦亡，進而增強ESCC細胞系對順鉑（DDP）的敏感性[14]。BI2536還可以通過促進caspase-8介導的凋亡通路的激活和PARP的激活來增加ESCC細胞系的凋亡，然而，BI2536對其他已知引起細胞凋亡的生化標記，如caspase-9、cytochromeC和自噬，并無顯著影響。

2.2.1 BI2536和DDP聯合用藥活化Caspase-3和增加DSDME胞質中的累積進而誘導焦亡^[14]

PLK1調控細胞周期，調控細胞增殖，而敲低PLK1可顯著抑制膠質瘤細胞U87和U251的增殖、遷移、侵襲，誘導細胞凋亡。此外，數據顯示，PLK1的下調顯著提高了U251和U87細胞中cleaved caspase-3、BIM、BAX和E-cadherin的表達，降低了MMP9、ATG5和LC3-II的表達[15]。靶向PLK1可能與自噬的調控有關。在對吉非替尼的抗癌研究中發現，肝臟特異性Atg7+/-雜合子小鼠的肝損傷比正常對照小鼠更輕，表明自噬參與了吉非替尼促進的肝毒性。而這種自噬促進的細胞凋亡依賴于PLK1 ，AAV-8介導的PLK1下調和PLK1抑制劑BI-2536都可以通過消除COX6A1蛋白的自噬降解來減輕吉非替尼誘導的肝毒性。此外，PLK1抑制不影響吉非替尼的抗癌活性[16]。PLK1與mTOR的相互作用也與自噬密切相關[17,18]。含有mSin1.5的mTORC2被認為在應激信號傳遞中具有重要功能，PLK1的Rictor磷酸化導致mSin1.5水平的增加，因此在調控該通路中也可能需要Rictor-S1162的PLK1磷酸化[19] 。研究發現，抑制PLK1可導致食管鱗癌和AML中mTOR活性的衰減[20,21]。相比之下，Ruf和他的同事描述了PLK1抑制HeLa細胞中的mTORC1，從而調節營養饑餓條件下的自噬[22]。

2.3 DNA損傷

人類基因組在各種外源性因素和內源性因素破壞造成不同類型的DNA損傷，包括DNA單鏈斷裂（SSB）、DNA雙鏈斷裂（DSB）和復制叉崩潰等。Rad51重組酶以細胞周期和DNA損傷反應的方式被Plk1在S14處直接磷酸化，隨后刺激CK2介導的T13磷酸化， CK2對Rad51的T13磷酸化觸發與MRN組分Nbs1的FHA結構域的直接作用，S14或T13處的Rad51磷酸化對于準確的HR以及細胞對IR和PPAR抑制的抵抗力中發揮著重要作用[23]。研究發現DSB修復因子CtIP是由CDK1/Aurora A和PLK1共同磷酸化的[24]。CDK1/Aurora A介導的CtIP在絲氨酸327處的磷酸化觸發了CtIP與PLK1 polo-box結構域的結合，進而促進PLK1在絲氨酸723處磷酸化CtIP。PLK1磷酸化的CtIP突變體不能啟動擴展末端切除，因此不能介導同源重組和G2/M檢查點，但可以介導MMEJ。這些數據暗示PLK1可能以CtIP為靶點，促進易出錯的MMEJ，并使G2/M檢查點失活[25]。PLK3介導的CtIP磷酸化促進了CtIP-BRCA1相互作用，從而啟動G1期的末端切除和非同源末端連接（NHEJ）[26]。

2.3 PLK1在DNA損傷修復中的作用^[23]

3.PLK1抑制劑在癌癥治療中的研究和應用

3.1 BI2536

Martin Steegmaier[27]報道了一種有效的哺乳動物PLK1小分子抑制劑BI 2536，BI 2536是第一種能誘導PLK1抑制的所有特征的強效和選擇性PLK1抑制劑，它能在低納摩爾濃度下抑制PLK1酶的活性。該化合、物可在具有不同組織來源和腫瘤基因組特征的人類癌細胞系中有效地引起有絲分裂停止和誘導凋亡，細胞在前中期停止，積累磷酸組蛋白H3，并包含異常的有絲分裂紡錘體。同時，BI 2536在耐受良好的靜脈劑量方案下，抑制裸小鼠人腫瘤異種移植瘤生長，誘導大腫瘤消退。

圖3.1 BI2536的結構圖

（圖3.1來自https://www.chemsrc.com/cas/755038-02-9_122800.html）

三陰性乳腺癌 (TNBC)的高發歸因于腫瘤起始細胞 (TICs)的存在，通過全基因組人類激酶小干擾 RNA (siRNA) 文庫篩選，發現PLK1可能成為治療TNBC 的潛在靶點。siRNA 或 BI 2536 抑制 PLK1 可阻止 TNBC 的生長，包括 CD44高/CD24 -/低TIC 亞群和乳腺球形成[28]。BI2536在腎上腺皮質癌[29]、前列腺癌[30]等也顯示出令人興奮的結果。在抗纖維化方面，BI2536也表現出其優勢[31]。BI 2536 不會對心肌細胞產生不利影響，但會嚴重影響原代成纖維細胞。成纖維細胞在具有單極紡錘體的有絲分裂中被停滯，并在長時間停滯后死亡。在 BI 2536 存在下，內皮素-1 和去氧腎上腺素刺激對心肌細胞和肥大反應沒有觀察到影響。

3.2 BI6727（volasertib）

BI6727，分子式C34H50N8O3，是一種二氫蝶啶酮類化合物的 ATP 競爭性激酶抑制劑，IC50為0.87 nM，在 BI 2536 二氫蝶啶酮的結構基礎上改良的。Volasertib選擇性抑制PLK1，在多種腫瘤細胞中誘導選擇性G2/M阻滯和凋亡，而在正常細胞中引起G1和G2期可逆的細胞阻滯而不發生凋亡。

圖3.2.1 BI6727的結構圖

（圖3.2.1來自https://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_CN_CB12501403.htm）

早在2009年，就有研究表明，通過免疫熒光顯微鏡和DNA 含量的熒光細胞分選分析BI6727對NCI-H460細胞增殖的抑制，在24 h，細胞停滯在G2-M期，結合細胞增殖結果，利用PARP的蛋白表達結果確定BI6727在48h誘導NCI-H460細胞的凋亡[32]。上述結果在膀胱癌研究中也得到證實[33]。體內實驗結果也表明，BI 6727能夠抑制對高濃度長春新堿耐藥的NCI-H460細胞和急性髓性白血病 (AML) 細胞系的增殖，在異位表達MDR1基因的黑色素瘤細胞系(BROmdr)中也得到了類似的結果，顯示出BI 6727對這些耐藥機制的低敏感性[34]。BI 6727的藥代動力學特征有利于腫瘤組織在小鼠和大鼠中持續暴露，具有較高的分布量和較長的終端半衰期。BI 6727在多種癌癥模型顯示出顯著的抗腫瘤活性，包括紫杉烷耐藥結直腸癌模型等[34]。迄今為止，BI 6727可以說是體外和體內最有效的 PLK1 抑制劑之一，已在 I 期和 II 期的試驗中顯示出治療潛力，并正在進行 III 期試驗。該抑制劑也已嘗試與其他抑制劑聯合使用，并取得了令人鼓舞的成功[35]。FDA授予PLK1抑制劑volasertib突破性治療稱號，當其與低劑量阿糖胞苷(LDAC)聯合使用時，可用于不適合強化緩解誘導治療的患者對抗急性髓系白血病(AML) [36]

圖3.2.2 BI6727對NCI-H460細胞的抑制和誘導其凋亡[32]

4. PLK1抑制劑聯合用藥的研究

單一療法目前存在一定的缺陷：1、由于患者之間表觀遺傳差異，對某些患者有效的藥物可能對其他患者無效；2、在腫瘤內，只有一小部分腫瘤細胞可能對藥物敏感，導致腫瘤不完全破壞；3、單一藥物作用會提高藥物的耐藥性。而針對單一療法現有的治療缺陷，聯合療法提供了以下策略：1、靶向兩種以上的途徑，以便消除具有不同遺傳背景的癌細胞；2、具有優于或者協同的抗癌作用，從而在細胞產生耐藥性之前迅速將其消除[37]。

和其他抗癌藥一樣，BI2536出現了耐藥性，Solanes-Casado S[38]等人在體外建立了耐BI2536的結直腸癌細胞系HT29R、RKOR、SW837R和HCT116R，研究耐藥細胞的AXL途徑、EMT和MDR1，并在RKOR中發現PLK1基因突變R136G，與耐藥性密切相關。Stehle等人證明，在降低橫紋肌肉瘤（RMS）細胞的細胞活力和集落形成能力方面，艾日布林（一種新型微管干擾藥物）與PLK1抑制劑BI2536的共同治療明顯比單一療法更有效[39]。另一項研究測試了BI2536和諾考達唑的聯合用藥，諾考達唑是一種微管毒物，可在DU145晚期前列腺癌（PCa）細胞中造成M期阻滯。這種組合治療能協同誘導癌細胞凋亡并抑制PCa細胞的活力，但不能抑制正常的前列腺上皮細胞[40]。HBCx-10模型是人類三陰性乳腺癌（TNBC）衍生的異種移植模型，在HBCx-10模型中，阿霉素和環磷酰胺與BI2536的組合可阻止腫瘤復發[41]。Lian等人評估了BI2536與順鉑聯合治療胃癌，結果表明，BI2536增強順鉑誘導的對順鉑耐藥胃癌細胞（SGC-7901/DDP）細胞活力和侵襲的抑制作用[42]。BI2536顯著提高了DNA烷化劑替莫唑胺（TMZ）在體外以及使用異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）突變星形膠質細胞的異種移植小鼠模型中的功效[43]。

結語

北京愛思益普生物科技股份有限公司（ICE）專注于從先導化合物篩選，優化到臨床前候選分子階段基于細胞和生化的藥物體外篩選技術和早期藥物機理研究，致力于建立全面的靶點篩選和體外生物學研究平臺。

在表觀遺傳學靶點的平臺拓展和方法研究方面，愛思益普研發團隊積級開展了靶向治療中PLK1靶點的研究和分析，已經通過酶學實驗研究了BI6727對PLK1激酶活性的作用。

愛思益普還可通過In-cell-Western、 HCS、Western Blot、qPCR、LC-MS等技術精確精準分析PLK1蛋白靶點、突變位點和聯合用藥。工作內容包括前期細胞培養、細胞生長曲線測定、目的化合物篩選等。ICE公司細胞種類貯備充足、設備前沿、理論知識充分，在實驗中積累了大量的研發經驗，建立體外酶學、細胞、DMPK、體內一體化平臺。為后期PLK1靶向藥物的開發及優化奠定良好基礎。