神經遞質是生物學上重要的內源性化學信使，廣泛存在于哺乳動物的中樞神經系統、腦組織和體液中，其含量測定對神經運動學、運動生理學、病理學、臨床醫學、疾病診斷等都有重要意義[1]。腦內的神經遞質一般分為單胺類、肽類、氨基酸等幾類。神經遞質含量的異常與焦慮癥、抑郁癥、阿爾茲海默病等腦疾病密切相關。ICE團隊利用液相色譜質聯用法對四種神經遞質（Glu、GABA、ACh、DA）檢測進行方法學驗證，并開展了兩種疾病動物模型腦內神經遞質的含量測試[2]。神經遞質含量的檢測對新藥研發的治療效果及作用機理研究具有重要的研究意義。
使用超高效液相色譜（UPLC）儀器根據不同化合物的化學性質進行方法建立，對化合物的線性、準確度、精密度進行數據收集，使用Waters Corporation的Empower軟件測量神經遞質（Glu、GABA、ACh、DA）的峰面積。使用Microsoft Excel 2010版進行數據處理，包括算術平均值（平均值）和標準差、精密度（%RSD）和準確度（%RE）。準確度計算公式：%RE=100×（實測濃度均值?標識濃度）/標識濃度。精密度驗收標準%RSD≤±10%，準確度驗收標準%RE≤±15%。組織測定濃度（μg/mg）=檢測濃度*稀釋倍數/組織重量，組織測定濃度（μg/g）=檢測濃度*稀釋倍數*1000/組織重量。使用GraphPad prism8對生物樣本檢測的神經遞質含量進行統計分析。
1.液相條件
2.標曲制備及結果
取一定量的Glu、GABA、ACh、DA標準品，用0.2%的甲酸水溶液分別將其溶解成1.00 mg/mL的母液，然后稀釋成0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.40 μg/mL的濃度點，進樣分析并擬合線性。其結果如下：
3.精密度及準確度樣品及結果
稱取一定量的Glu、GABA、ACh、DA標準品，用0.2%的甲酸水溶液分別將其溶解成1.00 mg/mL的母液，并稀釋成0.40、1.60、4.80?μg/mL的濃度點，進樣并數據處理，具體分析結果如下：
脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是革蘭氏陰性菌的表面抗原物質，可作為一種強有效的免疫刺激因子激活小膠質細胞，促進炎癥反應發生[3]。本次實驗通過對小鼠腹腔注射LPS (1mg/kg)來制備動物神經炎癥模型。6-羥基多巴胺(6-OHDA)是一種類似于去甲腎上腺素的化學制劑，具有較強的神經毒性，在大鼠腦內局部注射后能夠高選擇地引起交感神經腎上腺素能神經末梢的急性潰變，并逆行性造成神經元不可逆的損傷[4]。6-羥基多巴胺的作用機制是在腦組織內競爭性抑制多巴胺(DA)?[5]，并對線粒體呼吸鏈產生強有力的阻滯作用，導致局部抗氧化物含量及三磷腺苷(ATP)的產生明顯減少[6]，引起多巴胺能神經元(nigral dopaminergic neuron，NDN)的特異性凋亡、壞死[7]。1)?將動物置于冰上取材；
2)?稱重后加入組織裂解液；
3)?置于1.5 mL離心管中充分勻漿；
4)?超聲破碎兩次；
5) 14000 rpm，離心15 min；
6)?取上清于另一離心管；7)?重新離心一次，再次取上清液，-80℃保存；
8)?取樣品冰上溶化，離心后使用0.2 μm濾膜過濾；
9)?使用UPLC檢測。2.2.1 LPS誘導的神經炎癥模型的神經遞質檢測
Fig.1?利用UPLC-MS檢測LPS誘導的神經炎癥模型組與對照組小鼠的海馬組織中神經遞質含量，與對照組相比，模型組GABA、ACh、Glu含量明顯降低。2.2.2 6-羥基多巴胺制備帕金森病動物模型的神經遞質檢測
Fig.2?利用UPLC-MS檢測6-羥基多巴胺制備帕金森病動物模型小鼠的紋狀體中神經遞質含量，與對照組相比，模型組多巴胺（DA）含量明顯降低。對于神經遞質檢測，與傳統的HPLC-ECD檢測相比，UPLC-MS或UPLC-MS/MS具有靈敏度高，特異性強，檢測時間短的優勢。在四種神經遞質分析方法驗證中，其中線性、系統適用性、精密度和準確度均滿足生物樣本檢測要求；神經系統疾病模型中的神經遞質含量檢測結果顯示:（1）LPS誘導的神經炎癥模型中神經遞質GABA、ACh、Glu含量與對照組相比明顯降低（2）紋狀體組織中神經遞質多巴胺（DA）含量顯著降低可作為6-羥基多巴胺腦內注射制備帕金森病動物模型成功的一項檢測指標。ICE團隊后續會制備更多的神經系統疾病關聯的動物模型和推出更多的神經遞質檢測方法，來支持客戶的神經系統類疾病相關的申報與非申報項目。
【參考文獻】
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