NSD蛋白家族(nuclear receptor binding SET domain proteins)包含三個成員: NSD1、NSD2(又名MMSET或WHSC1)和NSD3(又名WHSC1L1)?，是與腫瘤發生相關的組蛋白甲基化轉移酶，對維持染色質穩定和基因表達調控具有重要作用[1]。

組蛋白賴氨酸甲基化轉移酶（Histone lysine methyltransferases, HKMTases）能夠催化1-3個甲基轉移到組蛋白H3和H4的特定賴氨酸殘基(K3, K9, K20, K27, K36和K79)上，是一類表觀遺傳調節酶[1-2]。

組蛋白賴氨酸甲基化轉移酶具有十分重要的生物學功能并且與多種疾病密切相關。

NSD蛋白家族是較新識別的一個組蛋白甲基化轉移酶家族，在多種疾病, 尤其是在腫瘤中常常表達異常。

對NSD蛋白家族的研究不僅有助于進一步了解相關腫瘤的發病機制，而且有助于發現新的腫瘤標志物與腫瘤治療的新靶點，具有潛在和重要的臨床應用價值[2]。

一、NSD蛋白家族的結構及生物學功能介紹

1.1 NSD蛋白家族的結構

NSD蛋白家族結構十分相似，都是由幾個關鍵結構域構成（圖1.1）。共同的結構域有SET結構域(suvar, enhancer of zeste, trithorax)、2個PWWP結構域（脯氨酸-色氨酸-色氨酸-脯氨酸結構域）和5個PHD結構域（plant homeodomain，植物同源結構域），以及NSD特異性的富含半胱氨酸組氨酸(C5HCH)的基序(圖1.2)。

不同的結構域為NID結構域（NSD1），一個HMG (high-mobility group) DNA結合域（NSD2）[3-4]。

圖1.1?NSD蛋白家族結構結構示意圖[4]

NSD1、NSD2和NSD3在氨基酸殘基703和1409之間有55%-68%的相同序列。高度保守的催化SET結構域和PHD結構域在轉錄調控和染色質重組中發揮關鍵作用。

PWWP結構域對NSD與甲基化的組蛋白H3和DNA的結合至關重要[5-6]，而PHD結構域在NSD與其他甲基化的組蛋白的相互作用中發揮著關鍵作用[7-8]。

NSD1、NSD2和NSD3蛋白分別有2、3、3個結構亞型（圖1.2）。以NSD2為例，NSD2是NSD家族中最短的蛋白，具有復雜的表達模式。

NSD2有3種亞型：第1種長型NSD2，由1365個氨基酸組成。第2種短型NSD2，由647個氨基酸組成。?第3種RE-IIBP(response element II-binding protein)，由584個氨基酸組成。

長型NSD2包含兩個PWWP結構域、一個HMG DNA結合域、四個PHD結構域、AWS、SET和post-SET結構域。

短型NSD2由一個PWWP結構域和一個HMG結構域組成。RE-IIBP由兩個PHD結構域、一個PWWP結構域和一個SET結構域組成，不含HMG結構域[4,30]。

圖1.2?NSD蛋白家族不同亞型蛋白結構示意圖[30]

1.2 NSD蛋白家族的分子生物學功能

盡管三種NSD蛋白在約700個氨基酸的模塊內具有高度相似性，但它們具有不同的功能，原因在于其SET結構域有不同的底物特異性。

NSD1、NSD2和NSD3介導了不同的致癌機制。NSD1涉及NSD1-NUP98(核蛋白98)融合、NF-κB通路和CpG(胞嘧啶/磷酸/鳥嘌呤)島啟動子高甲基化。NSD2涉及NEK7、

Wnt、NF-κB、γ-H2AX-MDC1通路和EZH2-microRNA-NSD2軸。NSD3則涉及NSD3-NUP98、BRD4-NSD3-CHD8、BRD8-NSD3-MYC的融合和NEK7、CCNG1、Wnt通路。

除了底物的特異性，NSD家族的PHD5-C5HCH模塊識別組蛋白H3能力的不同，也可能會募集NSD家族蛋白質到基因組不同的位置，從而導致了NSD家族三個蛋白質功能上的多樣性。

二、NSD蛋白家族與腫瘤的關系和靶向藥物研究進展

2.1 NSD蛋白家族與腫瘤的關系

2.1.1 NSD1與腫瘤的關系

NSD1功能的喪失是兒童發育疾病小兒巨腦畸形綜合征(Sotos Syndrome)的 主要致病原因[9]。而在腫瘤中，關于NSD1的研究主要集中NUP98(nucleoporin-98)-NSD1融合蛋白在急性髓性白血病(AML)中的作用[10-11]。

2.1.2 NSD2與腫瘤的關系

NSD2的高表達可以加速腫瘤細胞的增殖、抑制細胞凋亡以及促進腫瘤轉移。在急性淋巴細胞白血病(ALL)群體中, 存在高達14%的NSD2 E1099K點突變[13]。臨床病理相關研究顯示，NSD2蛋白水平在神經膠質瘤、神經母細胞瘤、卵巢癌?、子宮內膜癌和肝癌中高表達[13-16]。

NSD2蛋白水平在消化道腫瘤(大腸癌、胃癌及肛管癌)、膀胱癌、小細胞肺癌、女性生殖系統腫瘤和皮膚腫瘤中高表達, 與腫瘤分級和分期的相關性有待進一步分析[17-18]。

基因研究顯示, NSD2 mRNA在惡性膠質瘤、頭頸部腫瘤、肝癌、腎透明細胞癌、膀胱癌前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌中高表達，并且與腫瘤的分期正相關，與頭頸部腫瘤、前列腺癌和膠質瘤的不良預后相關[19]。

2.1.3?NSD3與腫瘤的關系

NSD3 調控神經嵴細胞的基因表達[20]，還可導致肺鱗癌癥[21]。研究表明NSD3在乳腺癌、急性髓性白血病、中線癌、肺癌等多種惡性腫瘤中有促進腫瘤發生的作用，可與NUP98、NUT融合或與BRD4、CHD8、MYC等相互作用，形成致癌復合物；也可以通過調控H3K36me2水平或EGFR（K721）甲基化，加速細胞周期進程，促進腫瘤發生[22-23]。NSD3不僅參與腫瘤的發生，還與腫瘤的不良預后及侵襲能力有關[24]。

2.2 靶向NSD家族蛋白以核小體為底物催化組蛋白甲基化的分子機制研究

NSD家族蛋白被認為是潛在的癌癥靶向藥物治療靶點[25-26]。已知NSD甲基轉移酶表現出一種自抑制狀態，其通過與核小體結合而解除自抑制，使組蛋白H3K36位點可以被二甲基化。

然而，這一過程的分子機制尚不清楚。

2020年12月23日，南方科技大學研究團隊作為第一作者單位，攜手北京師范大學王占新教授團隊、在Nature雜志在線發表了題為Molecular basis of nucleosomal H3K36 methylation by NSD methyltransferases的研究論文[27]。

該研究首次報導了NSD2和NSD3蛋白分別與核小體復合物的高分辨率冷凍電鏡結構，NSD2 和NSD3 的結構生物學研究也為小分子藥物研發提供了非常有價值的分子模型，意義十分重大。

同時揭示了NSD家族蛋白特異性識別和甲基化組蛋白H3K36的分子機制，為針對NSD家族蛋白過量表達和突變等引起的多發性骨髓瘤、急性淋巴細胞白血病等靶向治療研究奠定了分子基礎[27]。

該研究利用冷凍電鏡單顆粒技術，解析了NSD3、NSD3(E1181K/T1232A)致癌突變體（圖2.1）和NSD2(E1099K/T1150A)致癌突變體分別與核小體結合復合物冷凍電鏡結構[27]。

圖2.1?NSD3(E1181K/T1232A)與核小體復合物1:1結合后冷凍電鏡結構電子密度圖[27]

研究人員發現，NSD2/NSD3與核小體的結合會導致核小體出口處連接區域 (linker region) DNA打開，從而使NSD2/NSD3的催化結構域插入到打開的DNA片段與組蛋白八聚體之間（圖2.2a）。

NSD2/NSD3蛋白多個帶正電氨基酸與核小體SHL-7、SHL0位置處DNA磷酸骨架相互作用，將NSD2/NSD3穩定在核小體上（圖2.2b、d）。

與此同時，NSD2/NSD3與組蛋白H3的N端α螺旋、H2A的C末端有多個相互作用位點。

研究人員根據NSD3與核小體復合物結構信息設計了一系列突變體（圖2.2e、f），發現NSD3蛋白的催化活性均不同程度降低[27]（圖2.2c）。

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圖2.2 NSD3與核小體的相互作用和突變體對其活性的影響[30]

通過對比NSD2(E1099K/T1150A)與NSD3(E1181K/T1232A)核小體復合物結構發現（圖2.3g），NSD2中的致癌突變位點E1099K，即帶負電氨基酸E1099突變成帶正電氨基酸K1099后，NSD2與核小體之間的靜電作用增強，從而導致了NSD2活性增強（圖2.3h）。

NSD3致癌突變位點?T1232A，當蘇氨酸T突變成丙氨酸A，導致H3尾部向A1232位點靠近，形成了一對新的氫鍵，使H3K36更容易進入催化口袋，從而導致酶活性增強（圖2.3i）。

實驗發現這些致癌突變不僅增強了體外催化活性，而且促進了癌細胞增殖以及異種移植瘤生長[27]（圖2.4d、e、f）。

圖2.3 NSD2、NSD3致癌突變位點與核小體之間的相互作用[27]

圖2.4 NSD2（e、f）和NSD3（d）致癌突變對其活性和癌細胞增殖的影響[27]

以人骨肉瘤細胞U2OS作為研究對象，通過體內實驗和免疫印跡分析表明野生型和活性增強的突變型（E1181K、T1232A）NSD3會促進癌細胞的增殖并促進移植瘤在裸鼠體內的生長。

其中，癌細胞的增殖及移植瘤的增長速率與NSD活性增強突變蛋白的活性正相關。作為對照，減弱NSD蛋白催化活性的突變型（L1119A、Y1121A）則不會引起癌細胞的增殖和移植瘤在裸鼠體內的增長（圖2.5）[27]。

圖2.5 NSD2（a、b）和NSD3（c、d、e、f）活性增強和減弱的突變對

癌細胞增殖影響的WB分析[27]

該研究首次揭示了NSD家族蛋白以核小體為底物催化組蛋白甲基化的分子機制，以及其癌癥相關突變可能致病的分子機理，同時闡明了NSD蛋白中重要的致癌突變位點活性增強的分子激活機理。

NSD家族蛋白的過表達以及突變均會導致癌癥發生，為進一步理解NSD家族蛋白的生理功能以及靶向NSD家族蛋白的藥物研發提供重要分子基礎。同時指出，H3K36甲基化是癌癥表觀遺傳失調的一個重點[27]。

2.2 靶向?NSD 蛋白家族結構域抗腫瘤藥物研究進展

盡管許多研究證明了NSD1、NSD2、NSD3在各種癌癥中的生物學功能，但由于生物分析方法和NSD抑制活性驗證的諸多困難，以至于過去對NSD抑制劑的報道較少。

此外，由于所有NSD甲基轉移酶的SET結構域都存在一個獨特的自抑制環，使其底物結合位點難以靠近， 選擇性的有效NSD抑制劑開發工作因此受阻[28]。

同時，合成的小肽底物并不能激活 NSD 家族蛋白的催化活性，只有核小體底物存在時，NSD蛋白才能被激活，并特異催化核小體?H3K36 位點的二甲基化修飾[29]。?

但是 NSD 蛋白對核小體底物的傾向性以及激活的分子機制并不清楚。抑制NSD活性開始成為重要的抗腫瘤潛在靶點，開發靶向NSD家族蛋白的小分子抑制劑已經成為藥物研發的重要方向之一。

隨著靶向NSD家族蛋白以核小體為底物催化組蛋白甲基化的分子機制研究逐漸成熟[27]，開發靶向催化SET、PHD和PWWP結構域的小分子NSD抑制劑的研究也取得了新進展。

2.2.1靶向催化NSD-SET結構域小分子抑制劑研究進展

SET結構域的一端通過一個N端的αA螺旋插入到β-片層1旁邊，而另一端則通過AWS結構域（pre-SET）插入到β-片層3旁邊。S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)分子作為甲基供體，結合在SET和post-SET結構域之間。賴氨酸底物結合通道被一個26個氨基酸殘基組成的，連接SET和post-SET結構域的短規則loop阻斷。

該loop(也稱post-SET自抑制環)可以采用一種合適的構象以阻止H3K36接近SAM，這種自抑制構象能夠阻止組蛋白賴氨酸底物進入活性位點[27,30]（圖2.6）。

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圖2.6 post-SET自抑制環形成原理和結構示意圖[27]

研究人員利用高通量篩選方法發現了DA3003-1(13)，PF-03882845(14)，TCLPA54(15)和ABT199(16)。

體外實驗表明它們可與催化SET結構域結合而發揮對NSD2的抑制作用，進一步分析發現以上化合物對NSD1，NSD2，NSD3的抑制IC50為0.06-12μM。

此外，在人骨肉瘤細胞U2OS中，DA3003-1(13)和PF-03882845(14)也表現出對NSD2的抑制作用（圖2.7）[30]。

圖2.7 靶向NSD-SET結構域小分子抑制劑化學結構式（13、14、15、16）[30]

Post-SET結構域的自抑制環通過構象變化形成獨特的通道狀口袋以結合小分子。基于這種構象變化的關系的設計合成了甲基-氮雜環丙烷化合物25

(BT5)，其對NSD1的抑制IC50=5.8μM明顯增強，同時具有NSD2和NSD3的抑制IC50分別為26.7μM和14.3μM。

細胞分析表明，化合物25可選擇性地結合HEK293細胞的NSD1-SET結構域。機制研究表明，化合物25降低NUP98-NSD1靶基因HOXA9和MEIS1的表達，并通過削弱白血病細胞NUP98-NSD1活性而降低H3K36me2整體水平[30]（圖2.8）。

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圖2.8 靶向NSD-SET結構域小分子抑制劑（BT5）[30]

2.2.2靶向NSD-PHD結構域小分子抑制劑的研究進展

NSD蛋白的PHD結構域是開發小分子NSD抑制劑的重要靶向位點。米托蒽酮二鹽酸鹽(26, 拓撲異構酶II抑制劑)、奎納克林二鹽酸鹽(27,抗瘧藥物的吖啶類似物)和氯喹二磷酸鹽(28, 抗瘧藥物)作為靶向NSD1-PHD的先導分子，這些化合物能夠結合PHDVC5HCH，從而減少與鋅指結構域的相互作用（圖2.9）[30]。

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圖2.9 靶向NSD-PHD結構域先導分子化學結構式及其作用原理（26、27、28）[30]

2.2.3靶向NSD-PWWP結構域小分子抑制劑的研究進展

NSD蛋白的PWWP結構域在NSD甲基轉移酶活性中具有關鍵作用，因此，利用小分子干擾PWWP結構域的功能是抑制NSD活性的策略之一。

以靶向NSD3-PWWP1結構域的小分子為例，首先，研究人員從1899種化合物中鑒定出先導片段35和36（圖2.10A）。共晶結構表明35和36能與NSD3-PWWP1結構域的芳香性籠狀結構中的Tyr281、Trp284和Phe312殘基相互作用，35的吡唑環和36的甲基二氫噠嗪環與Tyr281和Phe312存在π-π相互作用。

同樣，35的吡啶環和36的苯環很好地適應Trp284形成的親脂平面，另外，35吡啶取代基的氮原子與Ser314形成氫鍵，36哌啶環的氮原子與Glu318形成氫鍵（圖2.10B）。

基于片段的篩選發現了小分子化學探針BI-9321(37)?（圖2.10A），是NSD3-PWWP1結構域的選擇性和強效的拮抗劑（圖2.10C）。為設計和合成NSD靶向的強選擇性抗癌藥物小分子提供思路?[30]。

圖2.10 靶向NSD3-PWWP1結構域先導分子化學結構式及其作用原理（35、36、37）[30]