導讀：通過噴霧干燥和冷凍干燥技術生產適合口服的高負荷胰島素納米顆粒

隨著生活水平提高、飲食結構和生活方式的改變，在過去的30年間全球糖尿病的患病率迅猛增長，據國際糖尿病聯盟（IDF）2021年全球糖尿病概覽第十版數據顯示，2021年全球約5.37億成年人（20-79歲）患有糖尿病，預計此后幾年，這一數字還將持續攀升。

作為唯一能夠降低血糖的激素，對于I型和Ⅱ型糖尿病人來說，胰島素是維持生命的必備藥品。但現有的胰島素藥品多為注射制劑，不易保存，用藥難度較大，患者心理負擔較大。于是，口服胰島素成為人類的追求之一。

在嘗試開發口服胰島素時，納米顆粒技術取得了重大的進展。納米顆粒可以有效地封裝和保護胰島素不被降解，從而有針對性地輸送到人體的特定部位。然而，納米顆粒制劑的使用有一些限制，主要是由于顆粒懸浮液的穩定性問題。目前，凍干技術是創造穩定的NPs的黃金標準。但是，凍干技術需要添加冷凍保護劑，占據了大部分的重量比，這大大降低了凍干后胰島素NPs的負載量。

在制藥工業中，噴霧干燥是一種著名的、廉價的、從液相中生成干粉的工業規模的工藝。對顆粒形成過程的控制允許對幾種生物活性化合物進行適當的封裝。此外，它也是制備用于口服的封裝蛋白質的一種有效技術。在噴霧干燥過程中，水的蒸發速度非常快，這有助于保持粒子核心的低溫度，因此允許其應用于封裝熱敏成分。由于在噴霧干燥封裝過程中不需要冷凍保護劑，因此，噴霧干燥可以用來生產具有高負荷含量的干燥NPs。

近日，The University of British Columbia的Anubhav Pratap-Singh團隊在Scientific Reports上報道了通過使用電離凝膠法建立殼聚糖和三聚磷酸鈉的交聯來生產胰島素負載NPs的過程。這項工作評估了凍干和噴霧干燥過程對負載胰島素的殼聚糖納米顆粒結構的影響。通過測量它們的尺寸分布、表面電荷、PDI、封裝效率和裝載量，評估了它們的重組能力。通過比較它們的胰島素保護效果、釋放行為和細胞攝取功效，也評估了不同脫水方法產生的再溶解納米顆粒的質量。

圖片來源：編譯原文截圖

研究表明，混合溶液的pH值以及殼聚糖和胰島素的比例是影響最終NPs的顆粒大小和封裝效率（EE）的兩個關鍵因素，因為它們直接影響到離子凝膠過程。混合溶液的pH值被證明與顆粒大小和封裝效率都有很高的關聯（圖1a）。此外，在殼聚糖/胰島素質量比高于2.5:1（w/w）的情況下制備納米顆粒時，EE沒有變化（圖1b）。因此，本研究中的最佳制備條件（pH6.0，殼聚糖/胰島素質量比為2.5:1）被用來制備含有胰島素的納米顆粒，以進行進一步的研究。在這種制備條件下，胰島素NPs的平均粒徑被優化為318 nm（圖1c），PDI為0.18，夾帶效率為99.4%，Zeta電位為9.8 mv，胰島素負載量為25.01%（m/m）。根據透射電子顯微鏡（TEM）的結果，優化后的納米顆粒大致呈球形，離散，尺寸相對均勻（圖1d）。

圖1. 胰島素NPs的參數優化：（a）pH值對胰島素NPs平均直徑和封裝效率（EE）的影響（在殼聚糖和胰島素的質量比為5:1的情況下制備）；（b）殼聚糖和胰島素的質量比對胰島素NPs平均直徑和封裝效率（EE）的影響（在pH值為6時制備）；（c）優化的胰島素NPs的顆粒大小分布；（d）優化的胰島素NPs的TEM顯微照片。

（圖片來源：Scientific Reports）

形態學分析表明，噴霧干燥可以使胰島素納米顆粒脫水而不需要冷凍保護劑，與傳統的冷凍干燥方法相比，在提高裝載能力、減少的添加劑要求和操作成本方面具有顯著的優勢。

對于不含甘露醇的凍干胰島素NPs，如圖2a所示，在掃描電子顯微鏡（SEM）下觀察到一個高度多孔的粉末結構，表面大而不規則且粗糙。脫水后的粉末中幾乎檢測不到離散的顆粒（圖2e）。

這些結果表明，在沒有任何冷凍保護劑的情況下，大多數NPs在凍干過程中被分解了。對于含有1%甘露醇的凍干和噴霧干燥的胰島素NPs，都觀察到NPs呈球形，表面光滑（圖2b, d, f, h）。不含甘露醇的胰島素NPs噴霧干燥后保持其球形形狀，但表面有皺紋（圖2c）。根據干燥的NPs的可見外觀，不含甘露醇的噴霧干燥NPs和冷凍干燥及含甘露醇的噴霧干燥NPs都形成了細小的NPs粉末（圖2f，g，h）。微粒子表面之間更高的表面積會誘發更高的溶解度，因此，更高的釋放率。

相比之下，在噴霧干燥過程中沒有冷凍步驟。因此，在這種方法中，甘露醇是沒有必要的。事實上，沒有甘露醇的噴霧干燥NPs產生的NPs更細。然而，在噴霧干燥過程中，甘露醇仍可作為一種膨松劑，使NPs具有更多的球形結構（圖2d），這有助于NPs的均勻釋放胰島素。本研究中，為了確保球形結構在脫水后能保持完整，甘露醇和殼聚糖的比例保持在5:1，這樣大量的膨松劑也能擴大干燥NPs的顆粒尺寸。

圖2. 不同脫水胰島素NPs的形態。(a) 不含甘露醇的凍干胰島素NPs的SEM圖像；(b) 含甘露醇的凍干胰島素NPs的SEM圖像；(c) 不含甘露醇的噴霧干燥胰島素NPs的SEM圖像；（d）含甘露醇的噴霧干燥胰島素NPs的SEM圖像。(e) 不含甘露醇的凍干胰島素NPs粉末的圖像；(f) 含甘露醇的凍干胰島素NPs的圖像；(g) 不含甘露醇的噴霧干燥胰島素NPs粉末的圖像；(h) 含甘露醇的噴霧干燥胰島素NPs的圖像。

（圖片來源：Scientific Reports）

在穩定性方面，所有的脫水NPs都在冰箱里保存了三個月。SEM結果表明，所有脫水NPs的形態在三個月的儲存期間沒有明顯變化（圖3）。

圖3. 儲存三個月的不同脫水胰島素NPs的形態：（a）含甘露醇的凍干胰島素NPs的SEM圖像；（b）不含甘露醇的噴霧干燥胰島素NPs的SEM圖像；（c）不含甘露醇的噴霧干燥胰島素NPs的SEM圖像。

（圖片來源：Scientific Reports）

隨后，該研究評估了胰島素NPs的釋放效果。結果顯示，游離胰島素在所有三種酶處理中都顯示出在4小時內快速消除胰島素（圖4a-c）。相比之下，用甘露醇冷凍干燥的NPs和用或不用甘露醇噴霧干燥的NPs的胰島素消除試驗顯示，這些NPs對酶消化的保護作用明顯較高，這與新鮮制備的胰島素NPs相似（圖4a-c）。這些結果表明，使用或不使用甘露醇的噴霧干燥和使用甘露醇的冷凍干燥可以保持NPs脫水后的胰島素保護能力。

圖4. 脫水胰島素NPs的保護作用和釋放行為：（a）胃蛋白酶溶液對胰島素的保護；（b）胰蛋白酶溶液對胰島素的保護；（c）α-糜蛋白酶溶液對胰島素的保護；（d）脫水NPs在pH=2.5溶液中的釋放行為；（e）脫水NPs在pH=6.6溶液中的釋放行為；（f）脫水NPs在pH=7.0溶液中的釋放行為。

（圖片來源：Scientific Reports）

最后，HepG2細胞被用來評估采用冷凍干燥和噴霧干燥方法脫水的NPs的細胞吸收情況。結果表明，封裝的胰島素比游離的胰島素在細胞吸收方面有更高的功效，這主要與研究中創建的胰島素負載NPs的尺寸較小有關（圖5）。

圖5. HepG2細胞與新鮮制備的NPs和脫水NPs孵育4小時后的吸收情況：（a）HepG2細胞吸收的FITC-胰島素的分布。(b) 流式細胞儀分析的熒光強度的幾何平均值（n = 3），*P < 0.05與自由胰島素相比。

（圖片來源：Scientific Reports）

這項工作表明，噴霧干燥可以使胰島素納米顆粒脫水而不需要冷凍保護劑，與傳統的冷凍干燥方法相比，在更大的裝載能力、更低的添加劑要求和操作成本方面創造了顯著的優勢。

編譯原文鏈接

Guo, Y., Baldelli, A., Singh, A. et al. Production of high loading insulin nanoparticles suitable for oral delivery by spray drying and freeze drying techniques. Sci Rep 12, 9949 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13092-6

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