CRISPR基因編輯系統自問世以來，已經成為用來研究細胞功能的強大工具。它在我們對癌癥生物學的理解方面產生重大影響，并且在不斷驅動新的發現，加快癌癥診斷和治療手段的開發。近日，Nature Reviews Cancer上的一篇綜述盤點了CRISPR系統在癌癥研究、診斷和治療方面的最新進展。今日這篇文章里，藥明康德內容團隊將與讀者分享這篇綜述的精彩內容，點擊文末“閱讀全文/Read more”，即可訪問綜述原文網址。

CRISPR對癌癥生物學研究的影響

癌癥的精準醫療策略依靠發現促進癌癥生長的基因突變，CRISPR基因編輯技術能夠快速和有效地產生基因敲除，調節內源基因表達和復制與癌癥相關的基因組變化。由于CRISPR技術的簡便和高效性，目前生成基因敲除小鼠模型已經成為常規操作。而且，通過將CRISPR基因編輯系統的所有組分選擇性地引入某些體細胞中，可以生成組織特異性的癌癥模型。比如，使用CRISPR在造血干細胞中編輯Tet2，Runx1，Dnmt3a，Nf1和Smc3基因可以激發急性髓系白血病。將CRISPR遞送到肝臟、胰腺或肺部能夠迅速生成具有復雜表型的癌癥模型。

▲利用CRISPR技術生成不同類型的癌癥模型（圖片來源：參考資料[1]）

綜述作者指出，CRISPR技術對癌癥研究產生的最大影響可能是CRISPR篩選。這種篩選使用靶向基因組中不同基因的指導RNA（gRNA）文庫，可以系統性地敲除細胞系或類器官中的任何基因，然后觀察基因敲除對癌細胞生長或藥物反應的影響。

CRISPR在癌癥研究方面的另一個重要應用是追蹤癌細胞的譜系變化。癌癥的一大特征是它的異質性，癌細胞不斷積累基因變異，導致產生具有不同特征的細胞克隆。理解腫瘤內部的異質性并且追蹤新克隆的產生和演化讓科學家們更全面地了解腫瘤發生。

目前，研究人員已經開發出多種基于CRISPR的追蹤策略，能夠在包含多種細胞克隆的混合細胞群體中，發現不同的細胞克隆，并且追蹤它們隨著時間推移的動態變化。CRISPR技術可以在細胞中引入獨特的條形碼，它們可用來標記癌細胞譜系。而最新的CRISPR記錄系統能夠在特定時間在基因組中引入標記，通過分析這些不同的標記，可以構建不同癌細胞克隆之間的譜系關系。

▲用于追蹤癌細胞克隆譜系的不同CRISPR策略（圖片來源：參考資料[1]）

CRISPR在癌癥診斷開發方面的應用

盡早發現癌癥給治愈癌癥提供最好的機會，CRISPR技術可以幫助開發出更為靈敏的分子診斷工具，輔助癌癥的早期檢測。基于Cas12和Cas13的CRISPR分子診斷系統已經被用于從患者腫瘤組織活檢中發現與癌癥相關的基因突變。它們在發現特定致癌基因突變序列后可以通過切割攜帶熒光報告蛋白的RNA序列，發出熒光信號。這一技術在新冠大流行期間被用于生產快速靈敏的新冠病毒檢測。同樣的平臺可用于生成高度靈敏的個體化癌癥發現和監控系統。

此外，CRISPR系統可用于在基因組的特定區域精準切下DNA片段，與傳統的隨機基因組片段化（fragmentation）手段相比，這種方式可以富集感興趣的DNA片段，與下一代基因測序相結合，可以在樣本量非常少的情況下，發現特定基因上的基因突變。這一技術目前正在臨床試驗中接受評估，用于發現卵巢癌中的p53突變。

CRISPR在癌癥治療方面的應用

在癌癥治療方面，CRISPR技術的主要應用之一是工程化改造免疫細胞，生成抗癌免疫療法。多個研究團隊已經顯示，使用CRISPR基因編輯靶向敲除T細胞的PD-1表達可以提高T細胞的抗癌活性。這類候選療法已經進入臨床試驗階段。

此外，在生產同種異體的“通用型”CAR-T細胞療法時，CRISPR基因編輯可以用于敲除內源性T細胞受體和來自健康供體的T細胞表面的人類白細胞抗原（HLA），從而降低異體細胞輸入帶來的免疫排斥和移植物抗宿主病風險。

而且，使用CRISPR/Cas9技術還可以將表達CAR的序列特異性地插入到細胞的T細胞受體α恒定區（TRAC）的基因位點，帶來CAR的一致性表達。在體外和小鼠模型中，這種方法生成的CAR-T細胞與常規CAR-T細胞相比，表現出增強的抗癌活性。

▲CRISPR工程化改造T細胞的多種方式（圖片來源：參考資料[1]）

在體外改造T細胞療法之外，使用CRISPR基因編輯直接靶向驅動癌癥的基因變異是一個吸引人，同時也非常困難的挑戰。理論上，通過CRISPR基因編輯直接糾正驅動癌癥的基因變異，或者殺死產生特定基因變異的癌細胞，可以達到抑制腫瘤生長的效果。然而，這一策略需要克服多重障礙，包括完成腫瘤特異性療法遞送，以及需要達到高效率的基因編輯。

目前的臨床前研究已經發現一些腫瘤特異性基因編輯的策略。比如，靶向致癌基因融合的CRISPR基因編輯系統可以在選擇性靶向腫瘤細胞的同時，擾亂促進腫瘤生長的基因變異。另一項臨床前研究讓CRISPR-Cas13a系統的轉錄受到NF-κB轉錄因子的控制，由于NF-κB在多種癌癥中被過度激活，這一策略可以在癌細胞中特異性表達CRISPR-Cas13a系統，敲低致癌基因的表達，達到抑制癌細胞生長的效果。

▲利用NF-κB控制CRISPR-Cas13a系統的表達，腫瘤特異性降解致癌基因（圖片來源：參考資料[4]）

在遞送技術方面，脂質納米顆粒（LNP）在遞送新冠mRNA病毒方面已經獲得巨大的成功。利用LNP遞送編碼Cas9的mRNA和gRNA在概念驗證研究中已經有效靶向有絲分裂必需的基因PLK1，在膠質母細胞瘤的小鼠模型中達到70%的體內基因編輯效率，造成細胞凋亡并且抑制腫瘤生長50%，改善生存期30%。在LNP表面偶聯靶向腫瘤特異性抗原的抗體也成功驅動分散的腫瘤選擇性吸取LNP，提高腫瘤特異性編輯效率。

整體來看，這些臨床前研究顯示了體內CRISPR基因編輯在治療癌癥方面的潛力，不過將CRISPR體內基因編輯轉化為可行的臨床期抗癌療法仍然需要很多努力。

局限和前景

雖然CRISPR在癌癥生物學領域有廣泛的用途，然而綜述作者指出，這一技術的進一步開發，特別是在臨床治療方面，仍然需要克服幾個局限性。Cas酶導致的DNA雙鏈斷裂可能引發無意的DNA片段丟失，在有些情況下可能驅動染色體碎裂（chromothripsis），從而影響正常細胞的功能。CRISPR技術導致的DNA雙鏈斷裂損傷可能刺激p53信號通路，導致細胞死亡或者篩選p53功能下降的細胞。此外，CRISPR系統的脫靶編輯可能性一直是研究人員關注的問題。

不過，雖然這些潛在局限性是推動CRISPR技術進一步發展的重要局限，目前科學家們已經開發出工具來發現和最小化這些事件的發生。作者表示，它們可能不會顯著阻礙CRISPR技術在臨床的應用。未來的5-10年里，CRISPR技術將真正步入臨床期療法的階段，在CAR-T療法和其它免疫細胞工程化方面的工作預示著它們將在治療癌癥方面具有有所作為。

在科學研究方面，CRISPR技術已經開始解決癌癥的很多根本問題，通過描述單個基因在癌癥細胞行為中的作用，它將為構建下一代免疫療法、揭示非編碼區域和調控元件在腫瘤發生中的作用等多個領域賦能。CRISPR技術在過去和未來都將是我們理解和治療人類癌癥的關鍵工具之一。

參考資料：

[1] Katti et al., (2022). CRISPR in cancer biology and therapy. Nature Reviews Cancer, https://doi.org/10.1038/s41568-022-00441-w

[2] Zhang et al., (2022). Application of the CRISPR/Cas9-based gene editing technique in basic research, diagnosis, and therapy of cancer. Molecular Cancer, https://doi.org/10.1186/s12943-021-01431-6

[3] Gong et al., (2022). CRISPR/Cas-Based In Vitro Diagnostic Platforms for Cancer Biomarker Detection. Analytical Chemistry, https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c02533

[4] Gao, et al., (2020). A new tool for CRISPR-Cas13a-based cancer gene therapy. Mol. Ther. Oncolytics, https://doi.org/10.1016/j.omto.2020.09.004

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