編譯丨范東東

創新型的細胞療法、基因療法有望徹底改變傳統醫學的想象，滿足未滿足的臨床需求并提供持久性治愈的可能。因此，該領域也引起了廣大制藥廠商的熱情和興趣，市場規模的復合年增長率高達54%。

EvaluatePharma預計，到2026年，該領域市場價值將達到590億美元。然而，制造這些復雜革命性新療法的難度非常大，其中的下游加工環節更是頗具挑戰。

圖1：細胞、基因、再生和核酸治療產品當前和預測銷售額（2020-2026年）

資料來源：EvaluatePharma，2021年7月

01基因治療產品

市場上目前已有多種基因療法獲批。通常來說，使用病毒載體是向基因治療產品的首選途徑，最常見的三種基因治療載體分別是腺病毒、腺相關病毒（AAV）和慢病毒（LV）。

表1：獲得許可的基因治療產品

表2：基因療法常見的病毒載體

常見的病毒基因療法包括以下兩種：

體內基因治療

使用病毒載體將基因引入患者體內的細胞并傳遞相應的基因。這種方法通常是為了增加或替換低水平轉基因編碼的蛋白質，Luxturna和Zolgensma是采用體內基因治療的代表性療法。

離體基因治療

從患者身上提取細胞并用病毒載體處理，再將基因傳遞給提取的細胞，然后將這些修飾過的細胞輸注回患者體內。嵌合抗原受體CAR-T療法普遍采用這種方法（比如Kymriah），通常使用慢病毒將基因傳遞給患者T細胞。使用蛋白質生物分子（如抗體），可以在氨基酸水平評估分子結構，并且可以同時確定色譜樹脂的精確結合位置。然而，使用病毒載體導致了制造工藝需要有更高級別的復雜性。病毒載體由數十到數百個單獨的蛋白質組成的納米粒子，而這些蛋白質以獨特的三維結構排列組合。

綜合來看，所有病毒基因療法的制造難度和下游挑戰都是相似的，具體取決于所使用的病毒載體類型，以及所傳遞的基因編碼和治療類型（體內或體外）。與單純的蛋白質產品相比，制備復雜的基因療法還需要考慮病毒載體的大小和復雜性。

02下游純化的挑戰

目前，有許多療法主要針對罕見疾病，使用病毒載體治療較小規模的患者群體。傳統上，純化策略更加專注于病毒大小和密度特性，涉及使用密度梯度超速離心等。AAV純化的典型過程十分復雜，需要利用空衣殼（1.32g/cm3）和完整衣殼（1.40g/cm3）之間的微小密度差異，通過超速離心的方法將空衣殼（非活性）與含轉基因衣殼活性分離。這一步驟非常耗時（數小時），而且需要重復進行多次，才能達到所需的衣殼分辨率。此外，用于形成梯度的化學制品（如氯化銫）價格昂貴，而且分離完成后還需要從最終產品中去除這部分雜質，并且整個處理過程是人工密集型產業，難以用機械自動化取代。

圖2：AAV純化的典型過程

制備過程的困難導致了基因治療產品的售價往往相當高昂（比如Zolgensma治療成本高達210萬美元），使其僅適用于需要小劑量病毒載體的情況。治療其他單基因疾病（如血友病、杜氏或帕金森病），需要更多可擴展的純化方法。

目前，研發人員已經通過多級色譜法技術，構建病毒載體下游加工的替代方法來解決這一問題。在制備過程中，清除宿主細胞成分（蛋白質、核酸）以及控制與所需產品相關的物種都是十分必要的，此外過程中還需要從含有轉基因的衣殼中分離出空衣殼。

03病毒載體層析

1、病毒載體的色譜矩陣

蛋白質純化通常使用多孔顆粒形式的層析介質，通過對流流動使蛋白質純化珠表面可以被吸附。蛋白質純化珠的孔徑為15至40nm，吸附的病毒載體將被限制在蛋白質純化珠表面，進而導致容量遭到了限制。雖然可以增加蛋白質純化珠的孔徑，但這將會降低蛋白質純化珠的結構完整性，使其難以裝入色譜柱。使用色譜固定相的替代形式也可用于病毒載體，包括離子交換、疏水相互作用、混合模式等。這些替代形式不受孔徑擴散問題的影響。

2、病毒載體的親和層析

基于蛋白A與IgG分子Fc區結合的親和層析是一種高效的捕獲機制，適用于所有單克隆抗體（mAb）產品，并且能夠制造出純度高于98%的產品。該平臺過程適用于單克隆抗體的開發制造及分離，目前已開發出可結合特定AAV血清型（8,9）或血清型組（1至5,1至9）的親和配體。然而，AAV需要在中性pH值下進行結合，而洗脫過程則需要將pH值降低至2至3。洗脫過程也需要嚴格控制，盡量減少AAV處于低pH值的時間，避免AAV載體發生失活。

3、空/全衣殼分辨率

除了完整衣殼和空衣殼之間的密度差異外，空衣殼的等電點（pI）也存在電荷差異，與完整衣殼相差0.4個pH單位。最佳的條件是在色譜模式pH值約為9的情況下進行陰離子交換，空衣殼會比完整衣殼更早洗脫。然而，對于制備工藝來說，該過程所需的梯度長度（100CV）是不切實際的，但在確定了空殼和滿殼的洗脫條件后，轉換為階梯梯度可以為衣殼分辨率提供可擴展的制造方法。

4、病毒載體大小

與來自宿主細胞的其他物種（例如蛋白質和核酸酶消化后的核酸片段）相比，病毒載體的大小意味著切向流過濾可以實現從宿主細胞雜質中有效地純化病毒載體。因此需要研發和使用新型的緩沖液，使其滿足避免病毒載體聚集的同時，能夠減少宿主細胞成分與病毒載體結合。

04前景

在證明了病毒載體可以為未滿足的醫療需求帶來臨床療效之后，制造下游面臨的主要挑戰是通過可擴展的工藝來降低制造成本，同時提供治療所需的高質量療法產品。盡管目前存在相應的解決途徑，但仍需要進一步完善和開發。

其中，血清型依賴就是AAV當前面臨的主要挑戰之一。由于臨床應用中需要使用不同的血清型來靶向定位患者不同的細胞或組織，因此開發適用于各種AAV血清型的穩健純化平臺仍然是一個需要解決的目標。此外，在簡化病毒載體下游工作流程中，需要進行突破的領域還包括對全衣殼均具有選擇性的樹脂開發。

05基因治療的新模式

目前，基因遞送領域有兩個熱點一直受到研發領域的關注。

第一個是使用細胞外囊泡（外泌體）做為治療載體。該載體可以穿過血腦屏障，這也是目前其他遞送方法無法實現的。外泌體做為潛在療法的純化，遇到的難題是如何與其他細胞外囊泡的分離。

第二個關注領域是信使RNA（mRNA）。在新冠疫苗中的成功使用加速了mRNA療法和脂質納米顆粒（LNP）遞送機制的發展。mRNA療法制備過程中，下游的挑戰與分子大小有關，mRNA療法的制造過程與病毒載體有很大不同，mRNA需要在DNA的基礎上進行基于酶的分子合成。

06總結

目有超過1000種療法正在研發當中，而這一事實也證明了在很長一段時間內，制藥廠商對細胞和基因療法仍將存在極大的興趣和熱情。

然而，為了實現持久性治愈的承諾，研發人員還需要密切關注和解決制造流程中的種種難題，進一步改善當前前沿療法高昂的成本和可用性問題。未來，制藥廠商如果能夠在下游純化領域進行突破改進，將為實現這一目標做出重大貢獻。

編譯原文：Challenges in downstream purification of advanced therapies

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